鰱魚重組Cystatin的原核表達(dá)、鑒定及對銅綠假單胞菌的抑制作用

陳 海，姜海洋，吳 睿，肖安蓬，何 杰，李 冉，馬璐陽，任陽陽，李樹紅*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

鰱魚重組Cystatin的原核表達(dá)、鑒定及對銅綠假單胞菌的抑制作用

陳 海，姜海洋，吳 睿，肖安蓬，何 杰，李 冉，馬璐陽，任陽陽，李樹紅*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

本實驗主要對鰱魚半胱氨酸蛋白酶抑制因子Cystatin進(jìn)行原核表達(dá)和純化鑒定，并研究重組Cystatin對銅綠假單胞菌的抑菌效果。首先用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)入pET-30-Cystatin的E.coli BL21（DE3）表達(dá)重組Cystatin蛋白，經(jīng)Ni2+-NTA鎳離子親和層析對其進(jìn)行純化，該重組蛋白在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上顯示單一條帶，分子質(zhì)量約20.6 kD，在TSK-GEL G2000SW凝膠過濾高效液相色譜上呈單一活性峰，純度為94.27%，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其分子質(zhì)量為20.9 kD；其次，利用抑制劑滴定曲線法，以偶氮酪蛋白為底物，確定重組Cystatin對木瓜蛋白酶（45.375 μmol）的一個抑制活性單位為0.718 μg；最后通過濾紙片擴(kuò)散法鑒定鰱魚重組Cystatin對銅綠假單胞菌的抑菌效果，結(jié)果表明Cystatin的添加量為20、60、120、 200 U/片時，抑菌圈直徑分別為8、9、13、26 mm。鰱魚重組Cystatin對銅綠假單胞菌的抑菌效果呈劑量依賴關(guān)系。

半胱氨酸蛋白酶抑制劑；鰱魚；原核表達(dá)；鑒定；銅綠假單胞菌；抑菌活性

半胱氨酸蛋白酶抑制因子（cysteine proteinase inhibitors，CPIs）可專一性地抑制半胱氨酸蛋白酶，廣泛分布于動植物組織、體液以及分泌液中。已知動物源CPIs中最主要成員為Cystatins超家族：Stefin（家族Ⅰ）相對分子質(zhì)量約10 000，無二硫鍵和糖側(cè)鏈；Cystatin（家族Ⅱ）相對分子質(zhì)量約12 000～14 000，有2 對二硫鍵，部分成員含糖側(cè)鏈；Kininogen（家族Ⅲ）相對分子質(zhì)量約50 000～120 000，有9 對二硫鍵及糖側(cè)鏈[1]。目前已有多位學(xué)者從魚的卵、肝胰、脾臟、垂體、血清以及皮等這些水產(chǎn)品加工的廢棄組織中分離純化出了Cystatins[2-9]。鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）在我國養(yǎng)殖廣泛，產(chǎn)量位居我國淡水魚第二[10]，在其加工中會產(chǎn)生大量廢棄下腳料，若能對其中的Cystatins加以利用，變廢為寶，將具有重要意義。

目前已有相關(guān)研究表明，某些陸生動物及植物來源的Cystatin（家族Ⅱ）表現(xiàn)了抑菌活性：人類唾液Cystatin SA能夠抑制伴放線凝聚桿菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）的生長[11]；人類重組Cystatin 9能夠抑制土拉熱弗朗西斯菌（Francisella tularensis）的生長[12]；小鼠來源的Cystatin S能夠抑制牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）的生長[13]；從雞蛋白中提取的Cystatin在低濃度即可對大腸桿菌（Escherichia coli）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）產(chǎn)生明顯的抑制效果[14]；長春花中純化的phytocystatin能夠抑制大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色釀膿葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[15]。目前尚未見魚源Cystatin（家族Ⅱ）抑菌活性的研究報道。為此，本實驗首先對鰱魚Cystatin進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定，確定其抑制活性單位后，進(jìn)行抑菌活性研究。對鰱魚重組Cystatin活性和抑菌特性的研究，可以為探索鰱魚下腳料中天然Cystatin的性質(zhì)，提供科學(xué)的信息并奠定必要的研究基礎(chǔ)，進(jìn)而為淡水魚加工廢棄物資源的合理綜合利用及精深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

轉(zhuǎn)入鰱魚Cystatin-pET-30a的工程菌E.coli BL（DE3）由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院水產(chǎn)加工理論與技術(shù)實驗室保存；銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院食品微生物實驗室提供。

LB培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrient agar，NA）均按常規(guī)方法配制。

異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、苯甲基磺酸氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、木瓜蛋白酶（papain，P4762，10 U/mg）、偶氮酪蛋白（azocasein）、半胱氨酸鹽酸鹽、Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe、Tyr-Gly-Gly-Phe-Met、乳鏈菌肽、細(xì)胞色素C、胰蛋白酶、胃蛋白酶原、牛血清白蛋白、γ-球蛋白 美國Sigma公司；考馬斯亮藍(lán)R-250 美國Amresco公司；中分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（14.4～94 kD） 天根生化科技（北京）有限公司；藍(lán)葡聚糖-2000 美國GE公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Biologic Duo Flow全自動中高壓層析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；B4i-BR4i大容量高速離心機(jī) 法國Jouan公司；JY-ECP3000電泳儀 北京市六一儀器廠；Ni2+-NTA鎳離子親和層析填料 德國Qiagen公司；LC-2010HT高效液相色譜系統(tǒng) 日本島津公司；THZ-98AB恒溫振蕩培養(yǎng)箱和LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；V-1100D分光光度計 上海美譜達(dá)公司；SW-CJ1F無菌操作臺 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重組菌的表達(dá)

將轉(zhuǎn)入鰱魚Cystatin-pET-30a的E.coli BL21（DE3）工程菌接種在LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素），于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。次日將菌液按1∶50接入LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL卡那霉素），于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 h。當(dāng)OD600nm為0.6時，加入1 mmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)5～6 h，5 000 r/min離心5 min，棄上清液，加10 mL洗滌液，再次5 000 r/min離心5 min，收集菌體稱質(zhì)量。加入1 mg/mL的溶菌酶，反復(fù)凍融3 次，超聲破碎菌體后用含尿素的裂解液梯度洗滌，8 000 r/min離心10 min，收集沉淀用于純化。

1.3.2 重組Cystatin蛋白的純化

用5 mol/L尿素（含50 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L PMSF、1 mmol/L EDTA）洗滌收集的蛋白沉淀。用Buffer A（含0.5 mol/L NaCl、1 mol/L尿素、5%甘油、50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5）進(jìn)行透析后，鎳柱親和層析純化目的蛋白；以50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含0.5 mol/L NaCl、1 mol/L尿素、5%甘油和0.3 mol/L咪唑，pH 8.5）洗脫，洗脫流速0.5 mL/min，收集蛋白峰部分，磷酸鹽緩沖液（含5 mmol/L半胱氨酸鹽酸鹽，pH 7.4）進(jìn)行透析脫鹽處理。參考Laemmli[16]的方法，采用14 g/100 mL分離膠和4 g/100 mL濃縮膠，對純化的樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）鑒定。電泳膠片經(jīng)凝膠成像儀進(jìn)行成像掃描，而后用Quantity One電泳圖像分析軟件分析目的蛋白的分子質(zhì)量。參考Bradford[17]的方法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.3.3 凝膠過濾高效液相色譜鑒定重組Cystatin

色譜條件：色譜柱為TSK-GEL G2000SW（3 000 mm× 7.80 mm，5 μm），流動相為含0.1 mol/L Na2SO4和7.69 mmol/L NaN3的0.1 mol/L磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗脫，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長280 nm。

以凝膠過濾高效液相標(biāo)準(zhǔn)品藍(lán)葡聚糖-2000測定TSK-GEL G2000SW的空體積V0，分別以Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe（0.573 kD）、Tyr-Gly-Gly-Phe-Met（1.046 kD）、乳鏈菌肽（3.35 kD）、細(xì)胞色素C（13 kD）、胰蛋白酶（23.3 kD）、胃蛋白酶原（43 kD）、牛血清白蛋白（66 kD）、γ-球蛋白（150 kD）標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，相同條件下進(jìn)行色譜分析，求得各自的洗脫體積Ve。以Ve與V0的比值作為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制TSKGEL G2000SW凝膠過濾高效液相色譜分離的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y =-0.426 9x+3.399 1（R2= 0.977 1）。將純化后的重組Cystatin經(jīng)0.22 μm針頭式濾器微濾后，上凝膠過濾高效液相色譜，通過目的峰峰面積比例進(jìn)一步鑒定其純度和分子質(zhì)量。

1.3.4 重組Cystatin蛋白抑制活性單位的確定

根據(jù)Li Dengkun等[18]的方法，采用木瓜蛋白酶（配制適當(dāng)濃度經(jīng)E-64滴定有效活性濃度為6.05 μmol/L）水解反應(yīng)底物Azocasein，并調(diào)節(jié)抑制劑的加入量使得木瓜蛋白酶水解Azocasein活性的抑制率處于30%～70%[19]，即可準(zhǔn)確測定抑制活性。本實驗將純化的Cystatin稀釋并設(shè)置系列添加量梯度，采用上述方法準(zhǔn)確測定重組Cystatin對木瓜蛋白酶的抑制活性，并繪制抑制劑滴定曲線，以完全抑制體系中木瓜蛋白酶（45.375 μmol）的Cystatin活性量為一個抑制活性單位（U）。

1.3.5 濾紙片法鑒定重組Cystatin的抑菌效果

采用濾紙片法[14]鑒定Cystatin對實驗菌株的抑菌作用。將銅綠假單胞菌接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)OD600nm為0.6時，吸取100 μL菌液均勻涂布于直徑為90 mm的NA平板的表面，貼上直徑為6 mm的無菌濾紙片，在濾紙片上分別滴加經(jīng)無菌處理的Cystatin 20、60、120、 200 U/片；同時，以等體積的無菌生理鹽水（0.85% NaCl）做對照。在4 ℃條件下靜置3 h，30 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h，測定抑菌圈的大小以判斷鰱魚重組Cystatin的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組Cystatin蛋白的表達(dá)和純化

由圖1可知，成功表達(dá)的重組蛋白Cystatin，通過尿素洗滌和Ni2+-NTA鎳離子親和層析，所得吸附部分樣品在SDS-PAGE中分子質(zhì)量20.6 kD處呈現(xiàn)單一條帶。層析純化后的蛋白經(jīng)Bradford法檢測質(zhì)量濃度為1.755 g/L。高效液相色譜分析顯示（圖2）：在18.988 min處出現(xiàn)單一蛋白峰，峰面積比例94.27%，蛋白純度較高。根據(jù)凝膠過濾高效液相上目的峰尖處的Ve與V0的比值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程測得重組蛋白Cystatin的分子質(zhì)量約為20.9 kD。

圖1 SDS-PAGE檢測純化的重組鰱魚CystatinFig.1 SDS-PAGE of the purified recombinant silver carp cystatin

圖2 TSK-GEL G2000SW凝膠過濾高效液相色譜鑒定重組CystatinFig.2 Identification of the recombinant cystatin by HPLC of TSK-GEL G2000SW

2.2 重組Cystatin抑制活性單位的確定

圖3 重組Cystatin 抑制活性滴定曲線Fig.3 Titration curve of recombinant cystatin inhibitory activity

圖4 重組Cystatin抑制活性滴定曲線的線性部分外推Fig.4 Extrapolation of the recombinant cystatin titration curve

由圖3可知，隨著Cystatin添加量的增加，木瓜蛋白酶殘余酶活力明顯下降，當(dāng)Cystatin添加量超過0.598 μg后，其殘余酶活力維持在15%左右。取滴定曲線的線性部分外推，如圖4所示，通過趨勢線可以推測出，Cystatin的添加量為0.718 μg時，理論上可將木瓜蛋白酶（45.375 μmol）完全抑制。因此，確定Cystatin的一個抑制活性單位為0.718 μg。

2.3 濾紙片法鑒定純化Cystatins的抑菌作用

圖5 Cystatin的抑菌作用Fig.5 Bacteriostatic action of the cystatin

由圖5可知，鰱魚重組Cystatin添加量約為14 μg/片（20 U/片）時抑菌圈直徑為8 mm，42 μg/片（60 U/片）時抑菌圈直徑為9 mm，84 μg/片（120 U/片）時抑菌圈直徑為13 mm，140 μg/片（200 U/片）抑菌圈直徑為26 mm。該結(jié)果說明鰱魚重組Cystatin對銅綠假單胞菌的抑制呈劑量依賴關(guān)系，且根據(jù)抑菌圈直徑大小，當(dāng)重組Cystatin為140 μg/片（200 U/片）時，對銅綠假單胞菌的抑制效果最為顯著。

3 討 論

目前已利用基因工程技術(shù)將多種不同生物來源的Cystatins基因進(jìn)行了成功表達(dá)。但在魚類Cystatins的克隆表達(dá)及其功能性質(zhì)研究方面還相對較少。Xiao Pingping等[20]研究表明體外表達(dá)的大菱鲆重組SmCytB具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性；Li Shuying等[21]通過分子克隆技術(shù)獲得的重組大黃魚Cystatin，其cDNA全長354 個核苷酸，編碼一個118 個氨基酸殘基的蛋白，其谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase，GST）融合蛋白對木瓜蛋白酶表現(xiàn)出明顯的抑制活性。本課題組對鰱魚Cystatin進(jìn)行了克隆表達(dá)，成功獲得了高純度、分子質(zhì)量約20.9 kD的鰱魚重組Cystatin。根據(jù)木瓜蛋白酶的活性抑制滴定曲線顯示，理論上0.718 μg的重組Cystatin可將45.375 μmol的木瓜蛋白酶完全抑制。

銅綠假單胞菌又稱綠膿桿菌，廣泛分布在水、空氣以及人和動物機(jī)體中，為條件致病菌。目前，有關(guān)Cystatin（家族Ⅱ）對銅綠假單胞菌抑菌效果的研究很少。Nordahl等[22]研究表明哺乳動物高分子Kininogen的結(jié)構(gòu)域5能夠有效殺死銅綠假單胞菌。Wesierska等[14]通過濾紙片法研究發(fā)現(xiàn)雞蛋白Cystatin對銅綠假單胞菌ATCC27853的抑菌效果明顯，Cystatin添加量為150 μg/片時能夠產(chǎn)生直徑為18 mm的抑菌圈，120 μg/片時抑菌圈直徑為16 mm，100 μg/片時無抑菌圈產(chǎn)生。本實驗對魚源Cystatin的抑菌效果進(jìn)行了研究，鰱魚重組Cystatin約84 μg/片（120 U/片）時，對銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑為13 mm，140 μg/片（200 U/片）抑菌圈直徑為26 mm，說明其對銅綠假單胞菌的抑制效果可能優(yōu)于雞蛋白Cystatin。

Cystatin主要作為一種分泌型抑制劑，其抑制假單胞菌的機(jī)制，一方面可能其通過抑制細(xì)菌本身分泌的胞外半胱氨酸蛋白酶而發(fā)揮抑菌作用。Wesierska等[14]在能夠分泌胞外半胱氨酸蛋白酶的細(xì)菌培養(yǎng)液中加入雞蛋白Cystatin，細(xì)菌的生長受到大幅度的抑制。但是也有研究發(fā)現(xiàn)，人類唾液Cystatin S和雞Cystatin抑制牙齦卟啉單胞菌是由于其具有抑菌氨基酸序列，與對牙齦卟啉單胞菌巰基蛋白酶的抑制無關(guān)[23]。

另外，Cystatins N端與半胱氨酸蛋白酶相互作用的保守序列，會與細(xì)菌微生物膜上的負(fù)電荷相結(jié)合，從而起到抑菌作用[24]。不僅如此，Cystatin還可能穿透細(xì)菌細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部，抑制胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶。與Cystatin相關(guān)的重組鼠附睪精子發(fā)生蛋白CST8-GST（融合蛋白）能夠抑制大腸桿菌，對大腸桿菌細(xì)胞膜穿透作用隨CST8劑量增加而增強(qiáng)[25]。本研究結(jié)果中鰱魚重組Cystatin對銅綠假單胞菌的抑菌機(jī)制還有待深入探究。

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Prokaryotic Expression and Identification of Recombinant Cystatin of Hypophthalmichthys molitrix and Antibacterial Activity on Pseudomonas aeruginosa

CHEN Hai, JIANG Hai-yang, WU Rui, XIAO An-peng, HE Jie, LI Ran, MA Lu-yang, REN Yang-yang, LI Shu-hong*
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

Prokaryotic expression, purification and identification of a cysteine proteinase inhibitor, cystatin, from Hypophthalmichthys molitrix were performed, and the antibacterial effect of the recombinant cystatin on Pseudomonas aeruginosa was investigated in this work. The cystatin was expressed by E. coli BL21 (DE3) transformed with pET-30-Cystatin with the induction of isopropyl-beta-D-galactose (IPTG), and purified by Ni2+-NTA affinity chromatography. The purified protein appeared as a single band on SDS-PAGE, corresponding to a molecular weight of approximately 20.6 kD. The same protein also appeared as a single active peak on the gel filtration HPLC of TSK-GEL G2000SW with a purity of 94.27% and a relative molecular weight of 20.9 kD, as calibrated by standards. The inhibitory activity of the cystatin against papain (45.375 μmol) was 0.718 μg, which was determined by inhibitor titration method with Azocasein as the substrate. The antibacterial effect of the recombinant cystatin on Pseudomonas aeruginosa was tested by filter paper diffusion method, and it was found that the diameters of the inhibition zones were 8, 9, 13 and 26 mm with the addition of 20, 60, 120 and 200 units of the cystatin, respectively. This suggests that the antibacterial activity of the cystatin on Pseudomonas aeruginosa is dose-dependent.

cystatin; Hypophthalmichthys molitrix; prokaryotic expression; identification; Pseudomonas aeruginosa; antibacterial activity

TS254.1

A

1002-6630（2014）21-0133-05

10.7506/spkx1002-6630-201421026

2014-06-08

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31101249）

陳海（1993—），男，本科生，研究方向為水產(chǎn)品加工理論與技術(shù)。E-mail：754386839@qq.com

*通信作者：李樹紅（1975—），女，副教授，博士后，研究方向為水產(chǎn)品加工理論與技術(shù)。E-mail：xiaoshu928@126.com