超聲波結(jié)合CMC-Na對馬血中血紅素提取工藝效果影響

代文婷，陶永霞，楊海燕，白羽嘉，馮作山*

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052)

血紅素廣泛存在于動物的血液、肌肉和某些植物組織中，是一類重要的含鐵天然卟啉化合物[1]，在食品、醫(yī)藥、化工、保健品等行業(yè)中有廣泛的用途。在食品工業(yè)中，血紅素可替代發(fā)色劑亞硝酸鹽及人工合成色素加入火腿、灌腸等食品中，所得制品切面色澤均勻、鮮艷美觀，保持肌肉固有的天然色彩，且口感韌性強(qiáng)、味道純正，也降低了亞硝酸鹽對人體的危害[2,3]；在醫(yī)藥行業(yè)中，血紅素不僅是半合成法制備膽紅素的前體，而且是制備抗癌、抗炎藥物的重要原料[4,5]；人體對血紅素鐵的吸收率是無機(jī)鐵的3倍[6]，在臨床醫(yī)學(xué)中，血紅素常用作高效的補(bǔ)鐵劑，可治療因缺鐵引起的貧血癥[7,8]。

對血紅素的提取已有相關(guān)報(bào)道，多以豬血、牛血、雞血等畜禽血為原料進(jìn)行提取。新疆擁有豐富的馬種資源，但其開發(fā)利用深度不夠，未能體現(xiàn)出獨(dú)特的價(jià)值。本研究以馬血為原料，采用超聲波結(jié)合CMC-Na提取血紅素，并選用Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法分析試驗(yàn)結(jié)果，最終得到馬血血紅素的最佳提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

新鮮馬血購買于新疆瑪納斯縣屠宰場；血紅素標(biāo)準(zhǔn)品（純度98% ）Sigma公司；檸檬酸三鈉、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、CMC-Na等均為分析純 天津市盛淼精細(xì)化工有限公司。

JY 92-IIN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；JJ-2 增力電動攪拌器 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；FA2104N電子分析天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；YY3009000型換膜式過濾器 美國Millipore公司；XX8200115型蠕動泵美國Millipore公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FE20型pH計(jì) 上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 超聲波結(jié)合CMC-Na提取馬血血紅素

試驗(yàn)在王超英[9]的基礎(chǔ)上，進(jìn)行工藝改進(jìn)，得到提取的工藝流程：新鮮馬血→加入檸檬酸三鈉 (8g/L)抗凝[10]→攪拌→4000r/min離心10min分離RBC→RBC中加入0.9%的生理鹽水離心兩次→加入去離子水溶血，攪拌均勻→超聲波破碎→調(diào)溶液pH值，使之達(dá)到珠蛋白和血紅素分離的最佳值，并連續(xù)攪拌2h→膜分離（流速1.7m/s，壓力 0.05MPa）→調(diào)節(jié)溶液 pH值→加入 CMC-Na(1.2%)懸浮液吸附，連續(xù)攪拌 2h提取血紅素→高速離心，分離出血紅素→洗滌，干燥→血紅素。

1.2.2 血紅素產(chǎn)率計(jì)算公式[11]：

血紅素總含量/g=提取樣品總質(zhì)量×樣品中血紅素純度

式中：m 為稱取樣品的質(zhì)量；V 為血紅素溶液體積，即100mL。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 超聲功率對血紅素產(chǎn)率的影響

RBC投料量為50mL，超聲時間為10min、去離子水的添加量為RBC的5倍、提取pH為5.5、CMC-Na添加量為10mL的條件下，考察超聲功率分別為195、260、325、390W時對血紅素產(chǎn)率的影響。

1.2.3.2 超聲時間對血紅素產(chǎn)率的影響

RBC投料量為50mL，超聲功率為325W、去離子水的添加量為RBC的5倍、提取pH為5.5、CMC-Na添加量為10mL的條件下，考察超聲時間分別為5、10、15、20min時對血紅素產(chǎn)率的影響。

對于有單獨(dú)公豬舍的豬場，應(yīng)想法使公豬舍的室溫保持在13℃～20℃，或者把公豬放入后備舍或妊娠母豬舍以維持公豬需要的適宜溫度，減輕降溫對公豬的影響。

1.2.3.3 去離子水的添加量對血紅素產(chǎn)率的影響

RBC投料量為50mL，超聲功率為325W、超聲時間為10min、提取pH為5.5、CMC-Na添加量為10mL的條件下，考察去離子水的添加量分別為RBC體積的2、3、4、5、6、7倍時對血紅素產(chǎn)率的影響。

1.2.3.4 提取pH對血紅素產(chǎn)率的影響

RBC投料量為50mL，超聲功率為325W、超聲時間為10min、去離子水的添加量為RBC的5倍，CMC-Na添加量為10mL的條件下，考察提取pH分別為4.5、5、5.5、6時對血紅素產(chǎn)率的影響。

1.2.3.5 CMC-Na的添加量對血紅素產(chǎn)率的影響

RBC投料量為50mL，超聲功率為325W、超聲時間為10min、去離子水的添加量為RBC的5倍，提取pH為5.5的條件下，考察CMC-Na的添加量分別為5、10、15、20、25mL時對血紅素產(chǎn)率的影響。

1.2.4 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert 8.06軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)，優(yōu)化血紅素的提取工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：

表1 響應(yīng)面分析因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

超聲功率對血紅素產(chǎn)率的影響結(jié)果見圖1。

圖1 超聲功率對血紅素產(chǎn)率的影響Fig.1 The influence of ultrasonic power on the yield of heme

由圖1可知，超聲功率對血紅素產(chǎn)率的影響比較顯著，隨超聲功率的不斷增加，血紅素的產(chǎn)率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)超聲功率調(diào)至325W時，血紅素產(chǎn)率達(dá)到最大值；當(dāng)超聲功率大于325W時，血紅素產(chǎn)率呈下降趨勢，可能是因?yàn)槌暡栈?yīng)雖有助于紅細(xì)胞破碎，但隨其強(qiáng)度增大及超聲還引起一定的化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致血紅蛋白變性凝聚[12,13]，致使血紅素的釋放受阻，進(jìn)而影響了血紅素的產(chǎn)率。綜合考慮生產(chǎn)過程中的各種因素，超聲波功率設(shè)定為325W。

2.1.2 超聲時間對血紅素產(chǎn)率的影響

超聲時間對血紅素產(chǎn)率的影響結(jié)果見圖2。

圖2 超聲時間對血紅素產(chǎn)率的影響Fig.2 The influence of ultrasonic time on the yield of heme

由圖2可知，超聲時間對血紅素產(chǎn)率影響較大，隨超聲時間的增加，血紅素的產(chǎn)率呈先上升后下降的趨勢，在10min時達(dá)到峰值，隨超聲時間的延長，產(chǎn)率開始下降。產(chǎn)生此現(xiàn)象可能是因?yàn)槌曔_(dá)到一定值后，空化趨于飽和，再延長超聲時間會產(chǎn)生大量無用氣泡，降低了空化強(qiáng)度，進(jìn)而影響了血紅素的產(chǎn)率。綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)中各種因素，超聲波時間選擇10min比較適宜。

2.1.3 去離子水的添加量對血紅素產(chǎn)率的影響

去離子水的添加量對血紅素產(chǎn)率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 V去離子水/VRBC對血紅素產(chǎn)率的影響Fig.3 The influence of deionized water/RBC (v/v) on the yield of heme

由圖3可知，去離子水添加量對血紅素提取影響較大，產(chǎn)率隨去離子水添加量的增加，呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)去離子水的添加量為RBC的5倍時，產(chǎn)率達(dá)到最大值，而后開始緩慢下降。這種現(xiàn)象可能是隨去離子水的添加，紅細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差逐漸增大，紅細(xì)胞吸水致細(xì)胞膜脹裂，利于其中血紅蛋白的釋放，但達(dá)到峰值后再繼續(xù)增加去離子水的體積，整個提取液的濃度降低，一定程度上抑制了CMC-Na對血紅素的吸附。所以綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)中各種因素，選取去離子水的添加量為RBC體積的5倍比較適宜。

2.1.4 提取pH對血紅素產(chǎn)率的影響

提取pH對血紅素產(chǎn)率的影響結(jié)果見圖4。

圖4 提取pH對血紅素產(chǎn)率的影響Fig.4 The influence of extraction pH on the yield of heme

由圖4可知，提取pH對血紅素產(chǎn)率有一定影響，隨提取pH值的增大，血紅素產(chǎn)率呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)提取液pH為5.5時達(dá)到峰值。這種現(xiàn)象可能是由于血紅素卟啉對脂質(zhì)雙分子層有親和作用，當(dāng)pH值在4.0～6.0時，卟啉與脂質(zhì)雙分子層摻和量最小，此時卟啉分布率最高，故提取液的pH值選取5.5較適宜。

2.1.5 CMC-Na添加量對血紅素產(chǎn)率的影響

CMC-Na添加量對血紅素產(chǎn)率的影響結(jié)果見圖5。

圖5 CMC-Na添加量對血紅素產(chǎn)率的影響Fig.5 The influence of amount of CMC-Na on the yield of heme

由圖知，血紅素產(chǎn)率隨CMC-Na添加量的增加呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)添加量為10mL時達(dá)到峰值。經(jīng)方差分析，添加量對血紅素產(chǎn)率沒有顯著性影響（P>0.05），因此在響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中不再把CMC-Na添加量作為一個因素考慮。

2.2 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)曲面結(jié)果分析

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Trial design and results

利用Design-Expert 8.06軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，建立血紅素產(chǎn)率與以上四個因素的二次多項(xiàng)回歸模型：

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of the response surface test

注：**.P<0.01，差異極顯著；*.P<0.05，差異顯著。

對回歸模型進(jìn)行方差分析，模型P<0.01，表明回歸模型極顯著；模型的一次項(xiàng)A、B、C均極顯著，D不顯著；二次項(xiàng)均極顯著；交互項(xiàng)BC極顯著，AB、AC、AD、BD和CD均不顯著。以上表明，各因素對血紅素產(chǎn)率的影響不是簡單的線性關(guān)系。失擬項(xiàng)P=0.4236＞0.05不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.9637，說明模型擬合程度良好，可用來分析和預(yù)測超聲波結(jié)合CMC-Na提取血紅素的結(jié)果。四因素對血紅素產(chǎn)率的影響順序?yàn)椋撼暪β剩綱去離子水/VRBC＞超聲時間＞提取pH。

2.2.2 因素間的交互作用

采用Design Expert 8.06軟件分析并繪制響應(yīng)面圖，如圖6-圖11所示。

圖6 超聲功率與超聲時間對血紅素產(chǎn)率交互影響的響應(yīng)面分析圖Fig.6 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of ultrasonic power and ultrasonic time

圖7 超聲功率與去離子水和RBC體積比對血紅素產(chǎn)率交互影響的響應(yīng)面分析圖Fig.7 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of ultrasonic power and deionized water/RBC (v/v)

圖8 超聲功率與提取pH對血紅素產(chǎn)率交互影響的響應(yīng)面分析圖Fig.8 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of ultrasonic power and extraction pH

圖9 超聲時間與去離子水和RBC體積比對血紅素產(chǎn)率交互影響的響應(yīng)面分析圖Fig.9 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of ultrasonic time and deionized water/RBC (v/v)

圖10 超聲時間與提取pH對血紅素產(chǎn)率交互影響的響應(yīng)面分析圖Fig.10 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of ultrasonic time andextraction pH

圖11 去離子水和RBC體積比與提取pH對血紅素產(chǎn)率交互影響的響應(yīng)面分析圖Fig.11 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of deionized water/RBC (v/v) and extraction pH

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)分析，最適條件值為超聲功率336.24W、超聲時間9.33min、去離子水的添加量是RBC的5.15倍、提取pH5.51，在此條件下血紅素的預(yù)測產(chǎn)率約為0.42g/50mL。考慮到實(shí)際操作的便利，將提取工藝修正：超聲功率為338W、超聲時間為10min、去離子水的添加量是RBC體積的5倍、提取pH為5.5。采用修正后的工藝參數(shù)進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)。血紅素產(chǎn)率分別為0.42、0.43、0.41g/50mL，血紅素產(chǎn)率試驗(yàn)均值為0.42g/50mL，與模型預(yù)測值相差不大，可見該模型可以較好地反映出超聲波結(jié)合CMC-Na提取血紅素的條件。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過Design-Expert軟件，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對超聲波結(jié)合CMC-Na提取馬血中血紅素工藝進(jìn)行設(shè)計(jì)并優(yōu)化，建立了提取血紅素的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化了提取工藝條件，得出最佳工藝條件：超聲功率為338W、超聲時間為10min、去離子水的添加量是RBC的5倍、提取pH為5.5時，血紅素產(chǎn)率達(dá)到最大值0.42 g/50mL，與預(yù)測值0.42g/50mL基本一致，說明響應(yīng)面法適用于對超聲結(jié)合CMC-Na提取馬血血紅素進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化。

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