吳海波 齊寶坤 江連洲 李 楊

馮紅霞1 曹 亮1 馬文君1 丁 儉1 王 瑞1

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，哈爾濱 150030）

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心2，哈爾濱 150028）

大豆不僅是優(yōu)良的油料作物，也是理想的食用蛋白資源。從不同品種中提取的大豆分離蛋白的組成、結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象及熱性質(zhì)均不同，對(duì)大豆蛋白的營(yíng)養(yǎng)性、功能特性有很大的影響［1］。蛋白質(zhì)的功能特性大體上可以分三類(lèi)：一是蛋白質(zhì)與水相互作用，二是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，三是蛋白質(zhì)的表面性質(zhì)。對(duì)于一些已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)表面性質(zhì)的分析表明，一些疏水基團(tuán)也會(huì)出現(xiàn)在蛋白質(zhì)表面，使蛋白質(zhì)表面也具有一定的疏水性。據(jù)有關(guān)研究指出蛋白質(zhì)的大分子結(jié)構(gòu)，表面疏水性是影響分子間相互作用的主要因素［2］。很多研究中得出結(jié)論：蛋白質(zhì)的表面疏水性是影響蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的最重要的因素。

不同的大豆蛋白組分（7S或11S）具有不同的分子結(jié)構(gòu)，其熱性質(zhì)和表面疏水性均不同，且大豆蛋白的熱性質(zhì)與其表面疏水性具有一定的關(guān)系。差示量熱掃描法（Differential Scanning Calorimetry，簡(jiǎn)稱(chēng)DSC）是20世紀(jì)60年代研究出的一種蛋白質(zhì)熱力學(xué)分析方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)熱性質(zhì)及熱穩(wěn)定性的研究［3］。熒光光譜法（色氨酸熒光光譜）是在三級(jí)結(jié)構(gòu)層面上來(lái)解析蛋白質(zhì)的構(gòu)象差異，同時(shí)分析其空間微環(huán)境的變化。

本試驗(yàn)分別采用DSC法和熒光光譜法對(duì)不同品種大豆分離蛋白的熱性質(zhì)和空間構(gòu)象進(jìn)行分析，結(jié)合對(duì)大豆分離蛋白表面疏水性測(cè)定，探討大豆蛋白的熱性質(zhì)和空間構(gòu)象對(duì)其表面疏水性的影響，進(jìn)而改善大豆分離蛋白的功能性質(zhì)，為其在食品中的實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大豆：品種為東農(nóng)46、黑農(nóng)46、皖豆24、五星4、冀 NF58、中黃13。

Lowry法蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒：上海荔達(dá)生物科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）：美國(guó)Sigma公司；Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、HCl、NaOH均為分析純。

低溫高速離心機(jī)：美國(guó)Beckman公司；PHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：中國(guó)上海雷磁公司；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；PE Pyris6差示掃描量熱儀：美國(guó)PULUSTA.XT公司；F-4500熒光分光光度計(jì)：日本HITACHI公司。

1.2 方法

1.2.1 大豆分離蛋白的制備

原料大豆經(jīng)去皮、粉碎后過(guò)60目篩，然后在40℃條件下采用正己烷萃取以制備脫脂豆粕。將脫脂豆粕按1∶15的質(zhì)量比與水混合，用2 mol／L NaOH調(diào)pH值至8.0，攪拌l.5 h后，將其懸浮液在4℃條件下10 000×g離心30 min，取上清液用2mol／L HCl調(diào)pH值至4.5。靜置后在4℃條件下6 000×g離心30 min，取蛋白沉淀水洗2次，最后取沉淀分散于水中并用2 mol／L NaOH調(diào)pH值至7.0。再在4℃條件下10 000×g離心30 min，除去少量的不溶物，將其蛋白溶液冷凍干燥后粉碎即得粉末狀大豆分離蛋白。蛋白質(zhì)含量的測(cè)定依據(jù)GB／T 5009.5—2010。

1.2.2 蛋白質(zhì)表面疏水性的測(cè)定

參考Kato等［4］的方法。采用ANS熒光探針?lè)?。分別稱(chēng)取0.025 g不同品種蛋白樣品溶于50 mL磷酸鹽緩沖液（0.01 mol／L，pH7.0）中，在室溫條件下攪拌1.0 h，然后在10 000×g離心30 min，取上清液用Lowry法測(cè)定蛋白濃度，并用同一磷酸鹽緩沖液依次稀釋?zhuān)舛?.005～0.5 mol／mL）后，取不同濃度樣品的溶液4 mL，分別加入40μL濃度為8 mmol／L的ANS溶液（用0.01 mol／L，pH7.0的磷酸鹽緩沖液配制），經(jīng)振蕩后靜置3 min，再測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度（FI）。試驗(yàn)中激發(fā)波長(zhǎng)λex＝370 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem＝490 nm，夾縫為5 nm。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度作圖，初始段斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)（So）。

1.2.3 蛋白質(zhì)熱性質(zhì)的測(cè)定

依據(jù)Tang等［5］的方法。利用PE Pyris 6-DSC熱力分析儀測(cè)定大豆分離蛋白樣品的熱力學(xué)特性。稱(chēng)取5 mg的樣品放入鋁盒中，再向其中加入10μL的0.01mol／L的磷酸緩沖溶液（pH 7.0），壓盤(pán)密封，室溫條件下放置6 h；將平衡好的樣品鋁盒放入到DPS操作臺(tái)左側(cè)，空白鋁盒放置在右側(cè)。溫度掃描范圍：20～120℃；升溫速率：10℃／min；在120℃保持1 min；隨后從120℃降溫至20℃，降溫速率：30℃／min。記錄此過(guò)程中大豆分離蛋白的變性溫度（T d）和變性焓變（ΔH）。所有的試驗(yàn)結(jié)果為3次測(cè)定值的平均值。

1.2.4 蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的分析

參考尹壽偉［6］的方法。采用F-4500熒光分光光度計(jì)測(cè)定大豆分離蛋白的內(nèi)源性熒光光譜（色氨酸熒光光譜）。將大豆分離蛋白樣品分別分散于0.01 mol／L磷酸緩沖液（pH 7.0）中，配制蛋白質(zhì)量濃度為0.15 mg／mL。熒光發(fā)散光譜分析以蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的色氨酸熒光基團(tuán)為探針，為了降低酪氨酸的貢獻(xiàn)，熒光光譜激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm，發(fā)散光譜掃描范圍為300～400 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬均為5 nm。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均數(shù)x±s。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS V17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異，采用Origin8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆蛋白含量

由表1可知，采用不同品種的大豆所提取分離蛋白的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于90%，純度較高，可用于本試驗(yàn)中蛋白質(zhì)組成和性質(zhì)的測(cè)定。

表1 不同品種大豆分離蛋白的蛋白含量（x±s，n＝3）

2.2 不同品種大豆分離蛋白的表面疏水性

圖1為不同品種大豆分離蛋白的表面疏水性。由圖1可以看出，6種大豆分離蛋白的表面疏水性也存在顯著性差異（P＜0.05），表面疏水性數(shù)值在650.44%與793.16%之間，且從大到小順序依次為：793.45（東農(nóng)46號(hào)）＞780.44（皖豆24號(hào)）＞767.71（黑農(nóng)46號(hào)）＞675.64（五星4號(hào)）＞663.57（中黃13號(hào)）＞650.43（冀NF58）。這表明不同品種大豆分離蛋白的表面疏水性不同，可能由于不同蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、構(gòu)象及其熱性質(zhì)不同，導(dǎo)致其表面疏水性的差異［7］。

圖1 不同品種大豆分離蛋白的表面疏水性

2.3 大豆分離蛋白熱性質(zhì)對(duì)表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)的熱力學(xué)分析就是通過(guò)測(cè)量蛋白質(zhì)在連續(xù)升溫破壞其高級(jí)結(jié)構(gòu)過(guò)程中所需的能量變化情況和變性溫度。通過(guò)計(jì)算示差掃描量熱儀（DSC）譜圖中最大峰對(duì)應(yīng)的溫度和峰面積可分別確定變性溫度（T d）及變性焓ΔH）。變性溫度反應(yīng)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，而變性焓則反映蛋白質(zhì)分子的疏水性或親水性，同時(shí)也表征蛋白質(zhì)分子的聚集程度（反映有序結(jié)構(gòu)所占比例）［8］。

6種品種的大豆分離蛋白的熱力學(xué)分析結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，6個(gè)品種大豆分離蛋白中7S球蛋白和11S球蛋白的ΔH值和Td值之間存在顯著性差異；6種品種大豆分離蛋白中11S球蛋白的Td值和ΔH值均高于7S球蛋白，也說(shuō)明11S球蛋白的熱穩(wěn)定性高于7S球蛋白。6種分離蛋白中7S球蛋白的Td值在74.2～78.1℃之間，11S球蛋白的Td值介于85.0～93.3℃之間，結(jié)合不同品種分離蛋白的表面疏水值對(duì)其分析，發(fā)現(xiàn)7S球蛋白與11S球蛋白的Td值與表面疏水性存在顯著的負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 -0.923（P＜0.01）和 -0.893（P＜0.05），說(shuō)明大豆蛋白的熱穩(wěn)定性越好，其表面疏水性越小；7S球蛋白的ΔH值在22.41～51.26 J·g-1之間，差異幅度較大，以冀NF58最高，中黃13號(hào)次之，東農(nóng)46號(hào)最低；11S球蛋白的ΔH值在35.68～67.53 J·g-1之間，其中中黃13號(hào)和冀NF58的ΔH值相對(duì)較高，東農(nóng)46號(hào)和皖豆24號(hào)的ΔH值較低，通過(guò)相關(guān)性分析得知，不同品種的大豆分離蛋白的7S球蛋白與11S球蛋白的ΔH值與表面疏水性也存在顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 -0.874（P＜0.05）和 -0.876（P＜0.05），即7S球蛋白與11S球蛋白的ΔH值越小，表面疏水性越大。分析原因是ΔH值越低，反映蛋白質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)所占比例越低，分子相對(duì)伸展，分子內(nèi)部的疏水性殘基暴露較多，導(dǎo)致蛋白質(zhì)具有相對(duì)較大的表面疏水性。

表2 6種分離蛋白的熱力學(xué)分析

2.4 大豆分離蛋白空間構(gòu)象對(duì)表面疏水性的影響

基于前面對(duì)大豆分離蛋白熱穩(wěn)定性和表面疏水性研究的基礎(chǔ)上，采用內(nèi)部熒光光譜（色氨酸熒光光譜）在三級(jí)結(jié)構(gòu)層面上來(lái)解析6種蛋白的構(gòu)象差異。6種大豆分離蛋白的內(nèi)部熒光光譜如圖2所示。本研究采用290 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)，所得圖譜主要是色氨酸（Try）為發(fā)射基團(tuán)的熒光光譜，表征色氨酸微環(huán)境極性的變化，是一種在三級(jí)結(jié)構(gòu)水平反映蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的比較靈敏的技術(shù)手段。熒光峰紅移表明熒光發(fā)射基團(tuán)（Try）更加暴露于溶劑，也就是熒光發(fā)射基團(tuán)的微環(huán)境極性增加，藍(lán)移則表明發(fā)射基團(tuán)（Try）位于更為疏水的微環(huán)境中，而熒光峰強(qiáng)度下降與熒光猝滅相關(guān)聯(lián)的（猝滅劑存在于溶劑或蛋白質(zhì)分子內(nèi)部）［9］。圖2所示，6種大豆分離蛋白具有典型的色氨酸發(fā)射光譜，6種分離蛋白的熒光峰分布在335.8～339 nm之間，依次為339 nm（東農(nóng)46號(hào)）＞338.4 nm（皖豆24號(hào)）＞337.6 nm（黑農(nóng)46號(hào)）＞337.2 nm（五星4號(hào)）＞336.6 nm（中黃13號(hào)）＞335.8 nm（冀NF58），熒光峰峰位之間存在顯著性差異（P＜0.05），并且不同品種的大豆分離蛋白隨著熒光峰峰位數(shù)值和峰強(qiáng)越大，所具有的表面疏水性越高。分析原因可能是由于6種大豆分離蛋白的色氨酸光譜熒光峰均大于330 nm，色氨酸殘基部分暴露于親水區(qū)［10］，熒光峰峰位數(shù)值越大（發(fā)生紅移），峰強(qiáng)越高，色氨酸殘基的微環(huán)境極性越強(qiáng)，埋藏在內(nèi)部的疏水基團(tuán)的暴露是導(dǎo)致表面疏水性增大的主要原因［11-13］，這與大豆品種密切相關(guān)。

圖2 6種大豆分離蛋白的熒光光譜圖

3 結(jié)論

采用差示量熱掃描（DSC）法和熒光光譜法對(duì)不同品種大豆分離蛋白的熱性質(zhì)和空間構(gòu)象進(jìn)行分析，結(jié)合對(duì)大豆分離蛋白表面疏水性測(cè)定，探討大豆蛋白的熱性質(zhì)和空間構(gòu)象對(duì)其表面疏水性的影響。通過(guò)差示量熱掃描發(fā)現(xiàn)不同品種的大豆分離蛋白的7S球蛋白與11S球蛋白的Td值、ΔH值與表面疏水性存在顯著負(fù)相關(guān)，即7S球蛋白與11S球蛋白的T d值、ΔH值越小，表面疏水性越大。分析原因是ΔH值越低，反映蛋白質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)所占比例越低，分子相對(duì)伸展，分子內(nèi)部的疏水性殘基暴露較多，導(dǎo)致蛋白質(zhì)具有相對(duì)較大的表面疏水性。熒光光譜表明6種大豆分離蛋白具有典型的色氨酸發(fā)射光譜，熒光峰峰位之間存在顯著性差異，并且不同品種的大豆分離蛋白隨著熒光峰峰位數(shù)值和峰強(qiáng)越大，色氨酸殘基的微環(huán)境極性越強(qiáng)，表面疏水性越高。這與大豆品種密切相關(guān)，埋藏在內(nèi)部的疏水基團(tuán)的暴露是導(dǎo)致表面疏水性增大的主要原因。

［1］Riblett A L，Herald T J，Schmidt K A，et al.Characterization ofβ-conglycinin and glycinin soy protein fractions from four selected soybean genotypes［J］.Agric Food Chem，2001，49：4983-4989

［2］Chuan-He Tang，Yan Jiang.Modulation ofmechanical and surface hydrophobic properties of food protein films by transglutaminase treatment［J］.Food Research International，2007，40：504-508

［3］Sorgentini D A，Wagner JR，Anon M C.Effects of thermal treatment of soy protein isolate on the characteristics and structure-function relationship of soluble and insoluble fractions［J］.JAgric Food Chem，1995，43（9）：2471-2479

［4］Kato A，Nakai S.Hydrophobicity determined by a fluorescence probemethod and its correlation with surface properties of proteins［J］.Biochem Biophy Acta，1980，624（1）：13-20

［5］Tang CH，Choi SM，Ma C Y.Study of thermal properties and heat-induced denaturation and aggregation of soy proteins by modulated differential scanning calorimetry［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2007，40：96-104

［6］尹壽偉.蕓豆蛋白的物化修飾及相關(guān)構(gòu)效機(jī)理研究［D］.廣州：華南理工大學(xué)，2009

［7］周筠梅，周軍賢.蛋白質(zhì)表面疏水性的研究［J］.生物物理學(xué)報(bào)，1996（4）：72-76

［8］Ma C Y，Harwallkar V R.Thermal Analysis of Food Proteins［J］.Adv Food Nutr Res，1991，35：317

［9］Pallarès I，Vendrell J，Avilès FX，et al.Amyloid fibril formation by a partially structured intermediate state of a-chymotrypsin［J］.Molecular Biology，2004，342：321-331

［10］Vivian JT，Callis P R.Mechanisms of tryptophan fluorescence shifts in proteins［J］.Biophys，2001，80（5）：2093-2109

［11］Lin L H，Chen K M.Preparation and surface activity of modified soy protein［J］.Applied Polymer Science，2006，102（4）：3498-3503

［12］Matemu A O，Kayahara H，Murasawa H，et al.Improved emulsifying properties of soy proteins by acylation with saturated fatty acids［J］.Food Chemistry，2011，124：596-602

［13］Krause JP，Mothes R，Schwenke K D.Some physicochemical and interfacial properties of native and acetylated legumin from faba beans（Vicia faba L）［J］.Agric Food Chem，1996，44（2）：429-437.