肖懷秋 李玉珍 林親錄 楊 濤 鄧 靖 龔春平

（湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥與生物工程系1，株洲 412004）

（中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院2，長(zhǎng)沙 410004）

（湖南工業(yè)大學(xué)包裝與材料工程學(xué)院3，株洲 412000）

（廣東佛山南海宏仁食品有限公司4，佛山 528000）

花生是我國(guó)重要的油料與經(jīng)濟(jì)作物［1］，其加工和綜合利用主要途徑是榨取食用油脂，每年產(chǎn)生花生粕約150多萬(wàn)t［2］。傳統(tǒng)熱榨法產(chǎn)生的花生粕由于高溫蒸炒和壓榨使蛋白質(zhì)變性嚴(yán)重，有效氨基酸破壞明顯，蛋白質(zhì)溶解度差，無(wú)法直接應(yīng)用于食品工業(yè)，主要用作畜禽或魚類飼料或肥料［3］，而且經(jīng)高溫?zé)嶙冃院?，蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)與生物學(xué)價(jià)值下降明顯，對(duì)精深加工產(chǎn)生了極大的限制。低溫冷榨法由于采取低溫（＜60℃）機(jī)械壓榨技術(shù)對(duì)去紅衣花生仁進(jìn)行壓榨，在實(shí)現(xiàn)花生油和花生蛋白分離的同時(shí)，能較好地保持花生粕蛋白的低變性，因而能最大程度地保持花生粕蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［3］。在花生粕中含約47%～55%的蛋白質(zhì)、氨基酸配比合理，且富含人體必需氨基酸［4］，但缺乏相應(yīng)的精深加工配套技術(shù)，造成了花生粕優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源的嚴(yán)重浪費(fèi)［5-6］。因此，加強(qiáng)低溫冷榨花生粕蛋白質(zhì)的精深加工具有很好社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。

蛋白質(zhì)經(jīng)酶促水解產(chǎn)生的小分子蛋白質(zhì)、多肽及氨基酸，特別是分子多肽比蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更好，生物吸收利用率比氨基酸更高，可直接為小腸黏膜吸收利用［7］，且蛋白質(zhì)酶促水解產(chǎn)物具有如抗氧化、抗菌、降血壓、免疫調(diào)節(jié)、抗血栓形成以及抗菌等多種生物學(xué)活性［8-10］。由于酶促水解反應(yīng)為非線性復(fù)雜體系，認(rèn)識(shí)酶解影響因素對(duì)酶解過(guò)程的作用規(guī)律對(duì)于控制限制性酶促水解反應(yīng)和保障產(chǎn)物特異性是極其重要的。響應(yīng)面優(yōu)化技術(shù)相比傳統(tǒng)正交優(yōu)化方法更適合于多變量復(fù)雜體系的優(yōu)化分析且可充分考慮因素間交互作用對(duì)響應(yīng)變量的影響，通過(guò)構(gòu)建經(jīng)驗(yàn)數(shù)值模型并經(jīng)過(guò)回歸分析和方差分析可用于尋找最優(yōu)參數(shù)組合和評(píng)價(jià)復(fù)雜體系中各因素的影響重要性［11］。Box-Behnken設(shè)計(jì)是最有效的響應(yīng)面優(yōu)化方法之一，在酶促水解制備活性多肽方面應(yīng)用較為廣泛［12］。本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面優(yōu)化分析方法以多肽含量為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)冷榨花生粕酶促制備多肽工藝進(jìn)行了優(yōu)化分析，以期為冷榨花生粕蛋白質(zhì)制備花生多肽的精深加工提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

低溫冷榨花生粕：德州宏鑫花生蛋白食品有限公司；中性蛋白酶：北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

Labconco冷凍干燥儀：美國(guó)Labconco公司；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；pHS-3CpH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 冷榨花生粕蛋白質(zhì)提取工藝

低溫冷榨花生粕→烘干→粉碎→堿溶2次（1 mol／L NaOH調(diào) pH 8.5，料液比 1∶15，50℃，2 h）→離心（4 000 r／min，15 min）→上清液酸沉（3 mol／L檸檬酸調(diào)pH 4.5左右，室溫靜置30 min）→離心（4 000 r／min，15 min）→收集蛋白凝塊→醇洗2次→加堿調(diào)整pH 6.5→真空冷凍干燥→花生粕蛋白粉

1.3.2 花生粕蛋白粉的酶促水解工藝

準(zhǔn)確稱取一定量花生粕蛋白粉于反應(yīng)器中，根據(jù)固液比要求添加適量蒸餾水?dāng)嚢柚练稚⒕鶆?，酶促水解前超聲波預(yù)處理10 min并于90℃預(yù)熱10 min，冷卻至室溫后調(diào)整到預(yù)設(shè)pH值，根據(jù)［E］／［S］準(zhǔn)確稱取中性蛋白酶添加到酶解反應(yīng)系統(tǒng)中，緩慢攪拌并維持酶解系統(tǒng)pH恒定。酶解結(jié)束后迅速置于沸水浴中滅酶10 min。冷卻至室溫后4 000 r／min離心10 min，收集上清液。

1.3.3 多肽測(cè)定

參考白永蓮等［13］報(bào)道方法，略有改動(dòng)。精密移取酶解液1 mL，加入雙縮脲試劑4 mL作為測(cè)定管；精密量取7%標(biāo)準(zhǔn)蛋白0.05 mL加0.9%NaCl 0.95 mL，再加4 mL雙縮脲試劑作為標(biāo)準(zhǔn)管；精密移取0.9%NaCl溶液1 mL加雙縮脲試劑4 mL作為空白管，分別于525 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。多肽含量計(jì)算公式：多肽含量 ＝［（A測(cè)-A空）／（A標(biāo)-A空）］×7%×0.05。

1.3.4 酶促水解制備花生粕多肽工藝優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

考察酶解 pH（4.0～10.0）、酶添加量（0.01～0.09 g／mL）、酶解時(shí)間（30～420 min）和底物濃度（0.01～0.13 g／mL）4個(gè)因素對(duì)酶解的影響，以產(chǎn)物中多肽含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.3.4.2 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上確定Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)中心點(diǎn)。試驗(yàn)因素及編碼見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素水平和編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

考察了酶解pH、酶添加量、酶解時(shí)間和底物濃度對(duì)酶促制備多肽的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酶解pH、酶添加量、酶解時(shí)間和底物濃度對(duì)多肽含量的影響

由圖1a可以看出，在pH 4.0～8.0區(qū)間內(nèi)隨著酶解pH的增加，酶解產(chǎn)物中多肽呈遞增趨勢(shì)，pH 8.0時(shí)酶解產(chǎn)物中多肽含量最高［（0.048±0.001 9）mg／mL］，當(dāng)pH再增加時(shí)酶解產(chǎn)物中多肽含量呈遞減態(tài)勢(shì)；由圖1b可以看出，在1%～7%g區(qū)間內(nèi)隨著酶添加量的增加，酶解產(chǎn)物中多肽呈遞增趨勢(shì)，最佳添加量為0.07 g／mL［（0.043±0.001 3）mg／mL］，隨后呈下降趨勢(shì)；由圖1 c可以看出，酶解最佳時(shí)間為180 min。在酶解時(shí)間為30～180 min區(qū)間內(nèi)，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，酶解液中多肽含量呈上升態(tài)勢(shì)。酶解時(shí)間為180 min時(shí)多肽含量達(dá)到最高［（0.051±0.001 1）mg／mL］，隨后呈下降趨勢(shì)；由圖1d可以看出，底物質(zhì)量濃度為0.01～0.09 g／mL區(qū)間內(nèi)，多肽含量隨底物濃度的增加而增加，隨后呈下降趨勢(shì)，最佳底物濃度為0.09 g／mL［（0.026±0.001 2］mg／mL。

2.2 酶促水解參數(shù)的響應(yīng)面優(yōu)化

探討了酶解時(shí)間X1、酶添加量X2、酶解pH X3和底物濃度X4對(duì)多肽制備的影響，結(jié)果如表2（含模型預(yù)測(cè)值）。

表2 酶解參數(shù)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)與結(jié)果（含模型預(yù)測(cè)值）

2.2.1 響應(yīng)面模型構(gòu)建序貫分析

基于方差分析和回歸分析對(duì)響應(yīng)面模型的構(gòu)建進(jìn)行序貫分析［2］，結(jié)果如表3所示。模型序貫分析發(fā)現(xiàn)，一階線性回歸模型顯著性分析為極顯著（P＜0.001），失擬項(xiàng)極顯著（P＝0.003 1＜0.01）。失擬項(xiàng)顯著表明，若用此模型進(jìn)行結(jié)果預(yù)測(cè)，出現(xiàn)失誤的概率比較大，需用更高階數(shù)值模型進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合［11］；二因素交互關(guān)系模型失擬項(xiàng)也極顯著（P＝0.003 3＜0.05），也不適宜對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)值模擬。二階模型顯著性分析為極顯著（P＜0.000 1），R2＝0.949 0，Adj.R2＝0.901 3，失擬項(xiàng)不顯著（P＝0.129 9＞0.05），表明用此二階模型進(jìn)行數(shù)值擬合是合理的，無(wú)需再用更高階模型。序貫分析還發(fā)現(xiàn)，三階模型顯著性分析不顯著（P＝0.761 6＞0.05），但由于擬合回歸方程相對(duì)較為復(fù)雜，實(shí)際應(yīng)用并不方便，因此，選擇二階模型對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合。

表3 響應(yīng)面模型構(gòu)建序貫分析

2.2.2 數(shù)值模型的擬合與模型回歸分析

表4 回歸模型方差分析表

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合可得方程，即y＝0．113 633+0．001 192x1+0．029 767x2-0．008 01x3-0．007 45x4+0．001 325x1x2+0．009 475 x1x3-0．024 48x1x4-0．002 53x2x3+0．011 85x2x4-0．000 63x3x4-0．016 94x12-0．021 2x22+0．001 783x32-0．021 58x42。

模型方差分析（表4）結(jié)果表明，回歸模型是極顯著的（P＜0.000 1），模型 R2＝0.949 0，說(shuō)明該模型能夠解釋94.90%的總變異，僅有5.10%變異無(wú)法用該模型解釋。模型確定系數(shù)越大表示模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值間擬合越好，該系數(shù)必須大于0.80［14］。模型Adj.R2＝0.901 3表明模型是顯著的。失擬項(xiàng)F值為2.85（P＝0.129 9＞0.05），表明失擬項(xiàng)不顯著，用該模型進(jìn)行多肽制備預(yù)測(cè)是切實(shí)可行的。變異系數(shù)（CV）是模型精度和可靠性的重要指標(biāo)，變異系數(shù)數(shù)值越小表明模型可靠性越好。本試驗(yàn)?zāi)Ｐ妥儺愊禂?shù)（CV）為9.91%，表明模型是高度可靠的?？煽磕Ｐ偷男旁瓯龋╯ignal to noise ratio，SNR）要求數(shù)值要低于4，本模型SNR＝17.793（＞4）表明模型信躁比是合理的。模型各系數(shù)項(xiàng)顯著性檢驗(yàn)如表5所示。

表5 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

由表5可以看出，一次項(xiàng)x1影響不顯著（P＞0．05），x2和 x3影響極顯著（P＜0．01），x4影響顯著（P＜0．05）；交互作用項(xiàng) x1x2，x1x3，x2x3和 x3x4交互作用不顯著（P＞0．05），x1x4影響極顯著（P＜0．01），x2x4影響顯著（P＜0．05）；二次項(xiàng) x12，x22和x42影響極顯著（P＜0．01），x32影響不顯著（P＞0．05）。

2.2.3 因素交互作用降維分析

響應(yīng)面分析中若觀察某兩個(gè)因素同時(shí)對(duì)響應(yīng)值的影響可借助降維分析［15］。等高線圖能直觀反映因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形則表示交互作用顯著。酶解時(shí)間X1和底物濃度X4的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響以及酶添加量X2和底物濃度X4的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響如圖2所示。由圖2也可以看出，X1X4交互作用項(xiàng)影響極顯著，而X2X4交互作用項(xiàng)影響顯著。

圖2 y＝f（X1，X4）和 y＝f（X2，X4）等高線圖

2.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化模型診斷

殘差分析是借助圖形分析工具并基于模型無(wú)法完全解釋變異的基礎(chǔ)上進(jìn)行的［15］，可用于響應(yīng)面優(yōu)化模型的診斷。在模型診斷中開(kāi)展誤差方差齊性檢驗(yàn)是非常重要的。如果預(yù)測(cè)值內(nèi)部t化殘差呈隨機(jī)散點(diǎn)分布（圖3），則殘差方差齊性是合符要求的。此外，殘差正態(tài)分布也是檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蜏?zhǔn)確性的重要工具，如殘差呈正態(tài)概率分布，則殘差擬合曲線呈線性態(tài)勢(shì)（圖4）［16-17］。由圖3和圖4可以看出，模型預(yù)測(cè)值內(nèi)部t化殘差呈隨機(jī)性分布，且為正態(tài)獨(dú)立分布。

圖3 預(yù)測(cè)值內(nèi)部t化殘差分布圖

模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值若擬合良好，則數(shù)據(jù)散點(diǎn)分布且沿模型診斷線呈近似直線分布［3］。模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值擬合如圖5所示。由圖5可看出，模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值擬合度較高，試驗(yàn)誤差較小。微擾曲線（Perturbation plot）可在響應(yīng)優(yōu)化曲面特定區(qū)域比較各自變量對(duì)響應(yīng)值的影響［11］，如曲線陡直，表明響應(yīng)值對(duì)因素敏感，如曲線平緩，則表明響應(yīng)值對(duì)因素變化不敏感。由圖6可看出，因素B（酶添加量，X2）對(duì)響應(yīng)值最敏感，因素C（酶解pH，X3）對(duì)響應(yīng)值較為敏感，而A（酶解時(shí)間，X1）和 D（底物濃度，X4）對(duì)響應(yīng)值變化不敏感。因此，因素B為最重要因素，其影響為正影響［11］。

圖4 內(nèi)部t化殘差正態(tài)分曲線

圖5 模型預(yù)測(cè)值vs實(shí)測(cè)值

圖6 微擾曲線

2.2.5 模型求解與驗(yàn)證試驗(yàn)

將回歸方程分別對(duì)各自變量求偏導(dǎo)數(shù)并令其等于0可得到四元一次方程組，解逆矩陣，得到方程組解為 x1＝0．60，x2＝0．56，x3＝0．98和 x4＝-0.37。經(jīng)轉(zhuǎn)換可得到因素實(shí)際水平為酶解時(shí)間198 min，酶添加量0.081 2 g／mL，酶解 pH 9.96和底物濃度0.082 6 g／mL。為實(shí)際操作方便，將優(yōu)化方案修約為酶解時(shí)間200 min，酶添加量0.081 g／mL，pH 10.0和底物質(zhì)量濃度0.083 g／mL。優(yōu)化條件下驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果為（0.135 6±0.001 4）%（n＝6），與模型預(yù)測(cè)值0.137 7%接近，偏差為1.55%。

3 討論與結(jié)論

酶促水解前對(duì)底物進(jìn)行超聲波預(yù)處理可利用超聲波空化作用與機(jī)械作用斷裂蛋白質(zhì)化學(xué)鍵，改善酶解微環(huán)境并提升酶解效率，同時(shí)還可改善酶解產(chǎn)物的功能特性［18］。酶促水解前的熱預(yù)處理也可以破壞維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵、范德華力等作用鍵，有利于蛋白質(zhì)的酶促水解。蛋白質(zhì)酶促水解是一個(gè)高度復(fù)雜的非線性灰色體系，具有高度的產(chǎn)物多樣性與動(dòng)力學(xué)復(fù)雜性［8］。為了對(duì)酶解過(guò)程進(jìn)行數(shù)值分析并研究各因素對(duì)響應(yīng)值的影響可采取響應(yīng)面優(yōu)化分析技術(shù)。本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化分析方法對(duì)酶促水解制備冷榨花生粕多肽工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化分析并構(gòu)建了相應(yīng)的數(shù)值模型，同時(shí)對(duì)模型進(jìn)行了回歸與方差分析。響應(yīng)面優(yōu)化方案為酶解時(shí)間200 min，酶添加量0.081 g／mL，酶解pH 10.0和底物質(zhì)量濃度0.083 g／mL。優(yōu)化條件下驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果為（0.135 6±0.001 4）%，與模型預(yù)測(cè)值0.137 7%接近，偏差為1.55%。研究表明，單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面優(yōu)化聯(lián)用可很好應(yīng)用于冷榨花生粕酶促水解制備活性多肽工藝的優(yōu)化分析。

［1］Jamdar SN，Rajalakshmi V，Pednekar M D，et al.Influence of degree of hydrolysis on functional properties，antioxidant activity and ACE inhibitory activity of peanut protein hydrolysate［J］.Food Chemistry，2010，121（1）：178-184

［2］胡志和，郭嘉.利用冷榨花生餅制備花生多肽飲料［J］.食品科學(xué)，2011，32（20）：335-340

［3］肖懷秋，李玉珍，林親錄，等.響應(yīng)面優(yōu)化冷榨花生粕酶法制備多肽工藝的研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2013，28（9）：50-55

［4］Ghatak SK，Sen K.Peanut proteins：Applications，ailments and possible remediation［J］.Journal of Industrial and Engineering Chemistry，2012，19（2）：369-374

［5］Wu HW，Wang Q，Ma T Z，etal.Comparative studies on the functional properties of various protein concentrate prepara-tions of peanut protein［J］.Food Research International，2009，42（3）：343-348

［6］劉明津.我國(guó)花生加工產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，（17）：161-164

［7］Gu L，Zhao M，LiW，etal.Chemical and cellular antioxidant activity of two novel peptides designed based on glutathione structure［J］.Food and chemical toxicology：an international journal published for the British Industrial Biological Research Association，2012，50（11）：4085-4091

［8］齊威，何志敏，何明霞.基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)知識(shí)解析活性多肽的酶解制備反應(yīng)行為（I）-酶解反應(yīng)動(dòng)態(tài)特性的32D圖形表［J］.化工學(xué)報(bào)，2005，56（12）：2387-2391

［9］Yu J，Ahmedna M，Goktepe I.Peanut protein concentrate：production and functional properties as affected by processing［J］.Food Chemistry，2007，103（1）：121-129

［10］Elias R J，Kellerby SS，Decker E A.Antioxidant activity of proteins and peptides［J］.Critical reviews in food science and nutrition，2008，48（5）：430-441

［11］Mason R L，Gunst R F，Hess J L.Statistical design and analysis of experiments：with applications to engineering and science［M］.New York：Wiley，2003

［12］Ferreira S L C，Bruns R E，F(xiàn)erreira H S，etal.Box-Behnken design：An alternative for the optimization of analyticalmethods［J］.Analytica Chimica Acta，2007，597（2）：179-186

［13］白永蓮，張洪林，邱峰.酶水解制備花生粕多肽工藝的優(yōu)化［J］.生物技術(shù)，2009，19（6）：74-77

［14］Chi G Y，Hu SQ，Yang Y H，etal.Response surfacemethodology with prediction uncertainty：A multi-objective optimisation approach［J］.Chemical Engineering Research and Design，2012，90（9）：1235-1244

［15］李玉珍，肖懷秋，楊濤，等.響應(yīng)面優(yōu)化低值豆粕液態(tài)制備多肽工藝［J］.大豆科學(xué)，2012，31（4）：649-654

［16］Montgomery D C.Design and analysis of experiments［M］.New York：Wiley，2008

［17］Draper N R，Smith H，Pownell E.Applied regression analysis［M］.New York：Wiley，1966

［18］鄧紅，仇農(nóng)學(xué)，孫俊，等.超聲波輔助提取文冠果籽油的工藝條件優(yōu)化［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2007，23（11）：249-254.