田亮，盧勉飛，林干，陳霖熙，蔡芷荷，吳清平

（1.廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，廣東廣州510663；2.廣東省微生物研究所，廣東廣州510663）

新型HK-MID-Listeria生化鑒定系統(tǒng)的鑒定效果評(píng)估

田亮1，盧勉飛1，林干1，陳霖熙1，蔡芷荷1，吳清平2，*

（1.廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，廣東廣州510663；2.廣東省微生物研究所，廣東廣州510663）

對(duì)新型HK-MID-Listeria生化鑒定系統(tǒng)的鑒定性能進(jìn)行評(píng)估。以傳統(tǒng)的生化鑒定為基準(zhǔn)方法，對(duì)分離自食品的101株李斯特氏菌野生株用HK-MID-Listeria和API-Listeria兩種鑒定方法進(jìn)行鑒定比對(duì)。結(jié)果表明：HK-MID-Listeria和API-Listeria兩種鑒定系統(tǒng)分別與傳統(tǒng)鑒定方法符合率分別為100%和93.1%；HK-MID-Listeria與API-Listeria兩者的符合率為93.1%。鑒定數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，HK-MID-Listeria與API-Listeria對(duì)李斯特氏菌屬的鑒定結(jié)果并無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。HK-MID-Listeria鑒定李斯特氏菌屬具有快速，簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，不需要特殊的儀器，成本低廉，更適合應(yīng)用在食品衛(wèi)生方面的檢測(cè)。

生化鑒定系統(tǒng)；HK-MID；API

李斯特氏菌屬（Listeria）為一種短小的革蘭氏陽(yáng)性無(wú)芽孢桿菌，DNA堿基組成G+C含量為36mol%～38mol%[1-2]，廣泛存在于環(huán)境當(dāng)中，僅部分種對(duì)人及動(dòng)物致病，導(dǎo)致腦膜炎、菌血癥和孕婦早產(chǎn)等[3]。在李斯特氏菌屬中，單增李斯特氏菌（L.Monocytogenes）是一種重要的病原菌，宿主主要是人和動(dòng)物。人感染李斯特氏菌99%是食用了單增李斯特菌污染的食品，尤其是即食類的食品。在美國(guó)每年大約有2 500人患李斯特氏菌病，病死率高達(dá)20%～30%[4]。因此，李斯特氏菌的分離和鑒定仍然是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。

從食品或者臨床樣本分離的李斯特氏菌的鑒定方法主要有以下幾種：一種是基于免疫學(xué)的方法主要有Vidas-Lis（法國(guó)梅里埃）、Listeria免疫試劑盒（法國(guó)Transia產(chǎn)品）和Listeria快速檢測(cè)產(chǎn)品（英國(guó)Oxoid）等，這些方法都是基于李斯特氏菌單克隆或多克隆抗體，能特異與李斯特氏菌鞭毛蛋白發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)，主要是針對(duì)李斯特氏菌屬特異性進(jìn)行鑒定[10]。另外一種是基于數(shù)值分類鑒定的方法-細(xì)菌數(shù)值鑒定法，是數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)與細(xì)菌鑒定學(xué)相結(jié)合產(chǎn)生的一種細(xì)菌概率鑒定方法。由于其具有快速、鑒定率高、便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為臨床和食品衛(wèi)生等領(lǐng)域細(xì)菌鑒定的主導(dǎo)方法。采用該技術(shù)的產(chǎn)品主要有API（Analytic Products INC）鑒定系統(tǒng)、羅氏公司的Micro-ID、Biolog和Microgen-ID鑒定系統(tǒng)等。

本研究旨在利用新型HK-MID-Lister鑒定系統(tǒng)對(duì)分離自食品的李斯特氏菌野生株進(jìn)行鑒定，以便于對(duì)HK-MID-Lister鑒定效果進(jìn)行評(píng)估。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基和試劑

API-Listeria試劑盒：生物-梅里埃公司；TSA-YE平板、血平板、HK-MID-Listeria鑒定試劑盒和傳統(tǒng)的生化鑒定試劑：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

1.1.2 測(cè)試菌株

廣東省微生物研究所提供的101株分離自食品的李斯特氏菌野生株，參考了食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)李斯特菌檢驗(yàn)方法[5]，利用傳統(tǒng)的生化試劑對(duì)這些菌株進(jìn)行了鑒定，其中單增李斯特氏菌（L.monocytogenes）69株，英諾克李斯特氏菌（L.innocua）25株，西爾李斯特氏菌（L.seeligeri）2株，威爾斯李斯特氏菌（L. welshimeri）3株，格式李斯特氏菌（L.grayi）2株。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

測(cè)試菌株在TSA-YE培養(yǎng)基上進(jìn)行轉(zhuǎn)接，按照API-Listeria和HK-MID-Listeria鑒定系統(tǒng)的說(shuō)明書進(jìn)行鑒定；傳統(tǒng)方法參考食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)-單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種鑒定方法的比較

用傳統(tǒng)方法、API-Listeria和HK-MID-Listeria同時(shí)對(duì)101株野生分離株進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.1 API-Listeria、HK-MID-Listeria分別與傳統(tǒng)的方法鑒定比較

從表1中可以得出，與傳統(tǒng)方法對(duì)李斯特氏菌屬的鑒定結(jié)果相比較，整體符合率HK-MID-Listeria和API-Listeria分別達(dá)到了100%和93.1%。傳統(tǒng)方法和HK-MID-Listeria對(duì)李斯特氏菌的鑒定完全相符，這兩種鑒定方法都是以糖發(fā)酵為主，兩種方法區(qū)別單增李斯特氏菌和無(wú)害李斯特氏菌都應(yīng)用了關(guān)鍵性的試驗(yàn)-溶血試驗(yàn)。而API-Listeria有兩個(gè)測(cè)定酶的反應(yīng)：甘露糖苷酶和芳基酰胺酶試驗(yàn)（DIM）。由此可見(jiàn)，生化反應(yīng)原理的差異可以引起具體結(jié)果的不同。

表1 三種方法鑒定結(jié)果的符合率Table1 The coincidence rate of the three methods

2.1.2 API-Listeria和HK-MID-Listeria的鑒定比較

從表1中我們可以得出，API-Listeria和HK-MIDListeria兩種方法的符合率為92.1%（93/101×100%）。其中，有2株單增李斯特氏菌不相符，其中1株單增李斯特氏菌API-Listeria不能鑒定，API的生化反應(yīng)DIM，RIB（甘露糖苷酶）兩個(gè)生化反應(yīng)全為陽(yáng)性，與李斯特菌的典型生化反應(yīng)不符。補(bǔ)做傳統(tǒng)的RIB生化實(shí)驗(yàn)和溶血性試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，接種血平板出現(xiàn)溶血環(huán)，為溶血性反應(yīng)，RIB結(jié)果為陰性，該菌株鑒定為單增李斯特氏菌。另外1株單增李斯特氏菌，API-Listeria鑒定為英諾克李斯特氏菌，其中DIM實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性，補(bǔ)做血平板的實(shí)驗(yàn)，出現(xiàn)了溶血，這兩株菌鑒定為單增李斯特氏菌。此外，API-Listeria對(duì)1株英諾克李斯特氏菌、2株西爾李斯特氏菌、1株威爾李斯特氏菌和1株格式李斯特氏菌不能給出鑒定結(jié)果。

2.2 HK-MID-Listeria和API-Listeria的鑒定差異

應(yīng)用兩種鑒定系統(tǒng)對(duì)李斯特菌屬的菌株進(jìn)行鑒定的數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果見(jiàn)表2，HK-MIDListeria鑒定系統(tǒng)和API-Listeria鑒定系統(tǒng)二者之間并無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表2 HK-MID-Listeria和API-Listeria鑒定李斯特氏菌結(jié)果差異Table2 Identification difference of API-Listeria and HK-MID-Listeria

3 討論

3.1 兩種鑒定方法的使用方便性和培養(yǎng)時(shí)間

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的初步研究，可以得出，兩種鑒定系統(tǒng)在鑒定李斯特菌屬方面并無(wú)顯著差異。Microgen公司的HK-MID-Listeria鑒定條已通過(guò)了國(guó)際AOAC的認(rèn)證。其鑒定系統(tǒng)中含有的12種生化反應(yīng)中，有3種特征性反應(yīng)：七葉苷、阿拉伯糖和海藻糖，這3種生化反應(yīng)中任意一種為陰性即可判定鑒定的菌株為非李斯特菌屬，這3種生化反應(yīng)可以提高HK-MIDListeria鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性[6]。HK-MID-Listeria的接種和培養(yǎng)明顯優(yōu)于API-Listeria，一方面對(duì)菌懸液的濃度沒(méi)有嚴(yán)格的要求；另外，HK-MID-Listeria鑒定條上面覆蓋有封口薄膜，可以防止在培養(yǎng)過(guò)程中液體過(guò)度蒸發(fā)，不需要額外維持濕室的濕度。此外，HK-MIDListeria可以從選擇性平板或者顯色培養(yǎng)基平板上挑取單菌落進(jìn)行鑒定；而API-Listeria對(duì)于鑒定的可疑菌落要求在非選擇性平板上生長(zhǎng)的純培養(yǎng)物，無(wú)論使用方便性還是鑒定過(guò)程的時(shí)間都明顯優(yōu)于API的鑒定方法。

3.2 單增李斯特和英諾克利特特異性的生化反應(yīng)

在李斯特氏菌鑒定中，單增李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌生物學(xué)特征和生化反應(yīng)基本一致，但是，單增李斯特氏菌能夠產(chǎn)生溶血素，這也成為單增李斯特氏菌與英諾克李斯特氏菌區(qū)別的關(guān)鍵性反應(yīng)。

HK-MID-Listeria鑒定系統(tǒng)利用了這個(gè)非常重要的生化反應(yīng)-溶血實(shí)驗(yàn)，用來(lái)區(qū)分單增李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌。在鑒定條上，第12孔為空白孔，添加血紅素到加有100μL菌懸液的第12個(gè)空的孔中培養(yǎng)，通過(guò)是否產(chǎn)生沉淀分層即可判斷陰陽(yáng)性，因此HK-MID-Listeria的鑒定實(shí)驗(yàn)不需要做溶血的補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)。

API-Listeria鑒定系統(tǒng)也設(shè)計(jì)了用于區(qū)分單增李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌的特異性試驗(yàn)：“DIM”即芳基酰胺酶試驗(yàn)。“DIM”的反應(yīng)結(jié)果通過(guò)顏色變化來(lái)判讀，陽(yáng)性反應(yīng)為橙色，陰性反應(yīng)為淡粉色或淺橙色，由于各種因素的影響，如：添加試劑不穩(wěn)定等因素，常常會(huì)造成反應(yīng)結(jié)為中間色，結(jié)果判讀比較困難，容易導(dǎo)致誤判。API-Listeria鑒定系統(tǒng)的“DIM”的反應(yīng)并不能完全替代溶血反應(yīng)，需要補(bǔ)充溶血性試驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)中，API-Listeria鑒定系統(tǒng)對(duì)幾個(gè)菌株不能鑒定其模式菌與其數(shù)據(jù)庫(kù)有很大的關(guān)系。APIListeria鑒定系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫(kù)主要是根據(jù)常見(jiàn)李斯特氏菌和臨床分離樣本建立的數(shù)據(jù)庫(kù)，致使從食品中分離的部分菌株的生化反應(yīng)模式不包含在API-Listeria的數(shù)據(jù)庫(kù)中[7]。

HK-MID-Listeria鑒定系統(tǒng)模式菌數(shù)據(jù)庫(kù)是基于從食品、藥品和臨床診斷等分離的菌株的鑒定來(lái)建立的。因此，HK-MID-Listeria鑒定系統(tǒng)更適合應(yīng)用從食品、藥品中分離的李斯特氏菌的鑒定。相對(duì)于APIListeria鑒定系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，HK-MID-Listeria鑒定系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫(kù)中缺乏環(huán)境如土壤等中李斯特氏菌的數(shù)據(jù)。

[1]Pongpan L,Scott AJ,Mark KM,et al.High Density Microarray Analysis Reveals New Insights into Genetic Footprints of Listeria monocytogenes Strains Involved in Listeriosis Outbreaks[J].PLoS One,2012,7(3):e32896

[2]王秀茹.預(yù)防醫(yī)學(xué)微生物學(xué)及檢驗(yàn)技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002

[3]Abram M,Schlüter D,Vuckovic D,et al.Murine model of pregnancyassociated Listeria monocytogenes infection[J].FEMS Immunol Med Microbiol,2003,35(3):177-182

[4]Roberts AJ,Williams SK,Wiedmann M,et al.Some Listeria monocytogenes Outbreak Strains Demonstrate Significantly Reduced Invasion,inlA Transcript Levels,and Swarming Motility In Vitro[J]. Appl Environ Microbiol.,2009,75(17):5647-5658

[5]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部(發(fā)布).GB4789.30-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)-單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010:2

[6]蘇麗春,蔡芷荷,陳素云,等.一種新的細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)-Microgen ID[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2010,20(2):315-318

[7]謝小保,歐陽(yáng)友生,陳儀本,等.API系統(tǒng)鑒定化妝品及一次性衛(wèi)生用品微生物種類的研究[J].微生物學(xué)雜志,2002,22(1):7-11

Evaluation of the New Biochemical Identification System-HK-M ID-Listeria

TIAN Liang1，LU Mian-fei1，LIN Gan1，CHEN Lin-xi1，CAI Zhi-he1，WU Qing-ping2，*
（1.Guangdong Huankai Microbial Sci.＆Co.，Ltd.，Guangzhou 510663，Guangdong，China；2.Guangdong Institute of Microbiology，Guangzhou 510663，Guangdong，China）

Identification performance of the new HK-MID-Listeria biochemical identification system was assessed.Based on traditional biochemical identification method，the HK-MID-Listeria identification system has been compared with that of the API-Listeria for the identification of101wild strains isolated from food.Results showed：the coincidence rate of the HK-MID-Listeria and the API-Listeria respectively compared with the traditional biochemical identification methods were 100%and 93.1%；The coincidence rate of the HK-MIDListeria compared with API-Listeria the was 93.1%.Base on the statistical analysis，there is no significant difference among two identification system（P＞0.05）in this study.The new HK-MID-Listeria biochemical identification system has a good prospect in estimating to be attributable to consumption of foods contaminated by Listeria.BecauseHK-MID-Listeria is a rapid，simple and economical method to identify Listeria.

biochemical identification system；HK-M ID；API

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.010.023

2013-02-27

廣東省財(cái)政廳項(xiàng)目（2011S-P1881）

田亮（1984—），男（漢），研究生，主要從事衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)技術(shù)研究。

*通信作者