張萍，王椿

記憶性T細(xì)胞在移植物抗宿主病中的作用的動物模型的建立

張萍，王椿

目的探討記憶T細(xì)胞在移植物抗宿主?。℅VHD）中的作用。方法用BALB/c小鼠致敏C57BL/6小鼠，8周后從C57BL/6小鼠分選出CD62L－記憶性T細(xì)胞移植給BALB/c受鼠，比較CD62L+初始T細(xì)胞與CD62L－記憶性T細(xì)胞引起GVHD的能力差異。結(jié)果接受CD62L+初始T細(xì)胞回輸?shù)氖苁?5 d內(nèi)全部死亡；接受CD62L－記憶性T細(xì)胞回輸?shù)氖苁?00 d內(nèi)存活率為89%；接受CD62L+與CD62L－混合細(xì)胞回輸?shù)氖苁?00 d內(nèi)存活率為4%，生存分析結(jié)果顯示CD62L+與CD62L－受鼠組間生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01），CD62L－受鼠組與全骨髓移植組間生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（=0.337）。第7天體質(zhì)量變化CD62L－受鼠組相比于CD62L+受鼠組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。結(jié)論CD62L－記憶性T細(xì)胞不引起GVHD，此種模型可以用來研究抗原特異性記憶性T細(xì)胞在移植物抗宿主病中的作用及其機(jī)制。

移植物抗宿主病；記憶性T細(xì)胞；動物模型

異基因造血干細(xì)胞移植為很多惡性血液病患者提供了治愈的希望[1]，然而干細(xì)胞移植后經(jīng)常發(fā)生的移植物抗宿主?。℅VHD）嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，如何減輕甚至避免GVHD已經(jīng)成為目前移植免疫研究的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬建立抗原特異性記憶T細(xì)胞動物模型以用來評估抗原特異性記憶性T細(xì)胞在GVHD中的作用，報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料受體鼠為SPF級近交系BALB/c（H-2d）小鼠，雌性，8～12周齡；供體為SPF級近交系C57BL/6（H-2b）小鼠，雌性，6～8周齡；均購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心。所有抗體除特殊說明外均購自BD公司，包括抗C D62LFITC（克隆MEL-14），抗CD45APC-cy7（克隆30F11），抗CD3PE-cy5（克隆145-2C11）；此外實(shí)驗(yàn)還使用RPM I1640培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清（FBS，Sigma）；牛血清白蛋白（BSA，Sigma）；紅細(xì)胞裂解液（ACK，實(shí)驗(yàn)室配置）；流式紅細(xì)胞裂解液（BD）；4%臺盼藍(lán)母液（Sigma）；T細(xì)胞分選試劑盒（M iltenyi）；兔血清補(bǔ)體（Cedarlane）；細(xì)胞毒性培養(yǎng)液（RPM I+0.3%BSA）等。

1.2 抗原特異性記憶性T細(xì)胞供鼠的準(zhǔn)備BALB/c小鼠經(jīng)頸椎脫臼處死后取出脾臟，研磨破碎并裂解紅細(xì)胞，洗滌離心后獲得的脾細(xì)胞經(jīng)2 000 cGY照射去除增殖能力，腹腔注射至C57BL/6小鼠體內(nèi)，8周以后致敏C57BL/6小鼠即準(zhǔn)備好。

1.3 供鼠去T細(xì)胞骨髓和對照組脾細(xì)胞的準(zhǔn)備取6～8周C57BL/6小鼠兩側(cè)股骨、脛骨及肱骨，盛于50m l完全RPM I培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用1 m l注射器吸取培養(yǎng)基，沖出骨髓，制備骨髓細(xì)胞懸液離心后棄去上清，按照1×107/m l濃度重懸于細(xì)胞毒性培養(yǎng)液中，按照每1×107細(xì)胞加入抗-Thy1.2單克隆抗體（克隆為30H 12，BD Pharm ingen）0.1 g的濃度，混合均勻后4℃孵育1 h，離心去上清，重懸于含有1∶10Low-Tox-M兔補(bǔ)體（Cedarlane）的細(xì)胞毒性培養(yǎng)液中，37℃孵育1 h，離心洗2遍后細(xì)胞計數(shù)，待用。此種方法得到的骨髓細(xì)胞含有少于0.08%的成熟T細(xì)胞。

1.4 流式分選抗原特異性T細(xì)胞BALB/c小鼠致敏的C57BL/6小鼠經(jīng)頸椎脫臼處死后去除脾臟并研磨破粹獲取脾細(xì)胞。裂解紅細(xì)胞后采用T細(xì)胞分選試劑盒獲得純化的T細(xì)胞，再經(jīng)免疫磁珠分選，以CD45+CD 3+射門，獲得CD62L+初始T細(xì)胞亞群與CD62L－記憶T細(xì)胞亞群。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組根據(jù)T細(xì)胞種類設(shè)計4組動物，分別為去T細(xì)胞骨髓移植組，骨髓細(xì)胞+CD62L－記憶T細(xì)胞亞群移植組，骨髓細(xì)胞+CD 62L+初始T細(xì)胞亞群移植組，骨髓細(xì)胞+混合T細(xì)胞移植組。

1.6 異基因骨髓移植GVHD模型的建立BALB/c受者小鼠首先接受10.5GY致死量照射，隨后經(jīng)尾靜脈回輸1×107去T細(xì)胞骨髓（TCD-BM）和供者T細(xì)胞（除非特殊說明，否則T細(xì)胞量為1×105）。受鼠每周測量體質(zhì)量，每天觀察生存狀況和GVHD癥狀，包括皮膚改變（脫毛、

紅斑等）、腹瀉及駝背癥等。如果小鼠處于瀕死狀態(tài)即連續(xù)2周體質(zhì)量下降超過20%則執(zhí)行人道處死。

1.7 統(tǒng)計方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，生存分析采用Long Rank檢驗(yàn)，＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GVHD發(fā)生情況初始T細(xì)胞移植組小鼠急性GVHD癥狀非常明顯，混合T細(xì)胞移植組的急性GVHD癥狀也非常明顯。CD62L－記憶性T細(xì)胞移植組小鼠急性GVHD癥狀不明顯，和去T細(xì)胞骨髓移植組類似。

接受CD62L+初始T細(xì)胞回輸?shù)氖苁笠浦埠?～5 d即開始出現(xiàn)急性G VHD癥狀，35 d內(nèi)全部死亡，中位生存時間為19.5 d；接受CD62L－記憶性T細(xì)胞回輸?shù)氖苁?00 d內(nèi)存活率為89%；細(xì)胞回輸?shù)氖苁?00d內(nèi)存活率為4%，中位生存時間為42d；接受去T細(xì)胞骨髓移植的受鼠100d存活率100%。LongRank檢驗(yàn)顯示，CD62L+與CD62L－受鼠組間生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（=0.001），CD62L－受鼠組與全骨髓移植組間生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（=0.337）。第7天體質(zhì)量變化1×105CD62L－受鼠組相比于1×105CD62L+受鼠組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（=0.00027），第7、14和42天1×105CD62L－受鼠組相比于混合細(xì)胞回輸組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均＜0.01）。見封四彩圖5，6。

2.2 病理學(xué)檢查CD62L+初始T細(xì)胞移植組和混合T細(xì)胞移植組肝臟、結(jié)腸病變，以結(jié)腸病變最為顯著，鏡下顯示發(fā)生GVHD組動物結(jié)腸正常結(jié)構(gòu)遭到破壞，腸壁不完整，細(xì)胞壞死；CD62L－記憶T細(xì)胞移植組和單純骨髓細(xì)胞移植組腸壁結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞完好。見封四彩圖7。

3 討論

隨著造血干細(xì)胞移植廣泛應(yīng)用于各種惡性血液疾病和干細(xì)胞來源疾病的治療，移植后GVHD越來越成為研究的熱點(diǎn)，近年來研究T細(xì)胞在GVHD中的作用越來越深入，尤其是T細(xì)胞亞群在GVHD中的作用得以重新評估[1-3]。記憶性T細(xì)胞因其獨(dú)特的抗原識別能力而備受重視，非抗原特異性記憶性T細(xì)胞不引起GVHD可能是因?yàn)樗麄儾皇强乖禺愋缘挠洃浶訲細(xì)胞，同時這種記憶性T細(xì)胞可以保持其免疫記憶功能并在移植物抗腫瘤效應(yīng)中起作用[4]。由于抗原特異性記憶性T細(xì)胞在免疫排斥和移植排斥中對抗原特異性識別，有必要研究這種抗原特異性記憶性T細(xì)胞在GVHD中的作用。

現(xiàn)有對記憶性T細(xì)胞的研究多針對非抗原特異性記憶性T細(xì)胞，這種T細(xì)胞是一群識別不同抗原的混合T細(xì)胞，而針對抗原特異性記憶性T細(xì)胞的動物模型大都是通過過繼性細(xì)胞轉(zhuǎn)移產(chǎn)生大量抗原特異性記憶性T細(xì)胞[3]，雖然這樣可以研究某種獨(dú)特抗原特異性記憶性T細(xì)胞的功能，甚至單個細(xì)胞，但是記憶性T細(xì)胞產(chǎn)生的環(huán)境是基于淋巴細(xì)胞減少及缺少初始T細(xì)胞的環(huán)境，這種特殊環(huán)境是否會影響記憶T細(xì)胞的功能尚不得而知，建立一種能夠產(chǎn)生自然狀態(tài)下的記憶性T細(xì)胞模型來研究其在GVHD中的作用是進(jìn)一步進(jìn)行機(jī)制探討的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)中，選用經(jīng)典的C57BL/6→BALB/c作為供受者誘導(dǎo)急性GVHD，同時使用BALB/c免疫刺激過的C57BL/6產(chǎn)生的記憶性T細(xì)胞作為記憶性T細(xì)胞來源，通過此模型可以生成穩(wěn)定的記憶性T細(xì)胞，而且這種T細(xì)胞是特異性針對宿主抗原的，正好可以用來研究抗原特異性記憶性T細(xì)胞不引起GVHD的機(jī)制。

綜上所述，抗原特異性記憶T細(xì)胞并不是根據(jù)是否見過抗原而決定是否會產(chǎn)生GVHD。自然狀態(tài)下機(jī)體產(chǎn)生的TEM不能引起GVHD，結(jié)合現(xiàn)有的研究結(jié)論，即自然狀態(tài)下產(chǎn)生的TEM可以骨髓移植后的免疫重建，并仍具有GVL作用[5]，使得記憶性T細(xì)胞在骨髓移植治療惡性血液病方面的前景十分可觀。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2014.05.047

R733

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