云南松基因組微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建

許玉蘭1，2張瑞麗2田斌2蔡年輝2康向陽(yáng)1段安安2
（1.北京林業(yè)大學(xué) 林木育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.西南林業(yè)大學(xué) 國(guó)家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224）

采用磁珠富集法構(gòu)建云南松微衛(wèi)星富集文庫(kù)。云南松基因組DNA經(jīng)RsaⅠ酶切，與特定接頭連接，再用接頭特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。連接擴(kuò)增產(chǎn)物與用生物素標(biāo)記的（AG）12、（AT）12、（CG）12、（GT）12、（ACG）12、（ACT）12和（CCA）8探針雜交，通過(guò)鏈霉親和素偶聯(lián)的磁珠捕捉含接頭和微衛(wèi)星序列的片段并擴(kuò)增，將獲得的片段連接到pMD-19T載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，成功構(gòu)建了云南松微衛(wèi)星富集文庫(kù)。通過(guò)PCR檢測(cè)從文庫(kù)中篩選陽(yáng)性克隆，在383富集陽(yáng)性菌落中獲得陽(yáng)性克隆257個(gè)，經(jīng)測(cè)序分析，在獲得的159條序列中，有143條含有SSR，其中完美型占65.73%，非完美型占23.78%，混合型占10.49%。結(jié)果表明，磁珠富集法構(gòu)建云南松基因組微衛(wèi)星文庫(kù)高效、可行的，文庫(kù)的構(gòu)建為微衛(wèi)星位點(diǎn)的分離、遺傳多樣性的分析等奠定基礎(chǔ)。

云南松 富集文庫(kù) 微衛(wèi)星

云南松（Pinus yunnanensis）自然分布于東經(jīng)96-108°、北緯23-30°之間，是分布區(qū)域內(nèi)瘠薄荒山造林的先鋒樹(shù)種和治理水土流失的重要樹(shù)種，占云南省林地面積的52%、占有林地蓄積的32%，

在云南林業(yè)經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)和生態(tài)建設(shè)中占有舉足輕重的作用［1，2］。然而，目前云南松的退化現(xiàn)象比較明顯，急需對(duì)現(xiàn)有的資源進(jìn)行評(píng)價(jià)，以制定切實(shí)可行的遺傳保護(hù)策略。遺傳變異的研究在開(kāi)展植物育種及保護(hù)策略中的作用已引起廣泛的重視［3］，分子標(biāo)記是分析遺傳變異的有效途徑［4，5］，其中微衛(wèi)星標(biāo)記具有高度的多態(tài)性而成為常用的分子標(biāo)記。這種多態(tài)性早在1989年Weber和May［6］就提出檢測(cè)的方法，即采用成對(duì)的特異引物（由少數(shù)核苷酸組成，通過(guò)與微衛(wèi)星側(cè)翼序列來(lái)設(shè)計(jì)）對(duì)基因組總DNA擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同個(gè)體擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性的檢測(cè)。擴(kuò)增引物的分離需要克隆和測(cè)序獲得［7］。目前，微衛(wèi)星分子標(biāo)記在云南松的研究中應(yīng)用較少。鑒于此，本研究利用磁珠富集法［8］構(gòu)建云南松微衛(wèi)星DNA富集文庫(kù)，為進(jìn)一步篩選云南松微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記奠定基礎(chǔ)，以期利用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行云南松群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，為云南松種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)、核心群體的構(gòu)建以及保護(hù)策略的制定提供遺傳學(xué)信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來(lái)源 云南松樣品材料取自2年生云南松幼嫩新鮮針葉。

1.1.2 主要試劑 所需基因組提取試劑盒購(gòu)于Tiangen，DNA限制性?xún)?nèi)切酶RsaⅠ、XmnⅠ和連接酶T4購(gòu)于New England Biolabs（NEB），TaqDNA聚合酶購(gòu)于TaKaRa，Dynabeads鏈霉親和素磁珠M-280試劑盒（Dynalbeads M-280 Streptavidin，112-05D）、磁珠收集器（Dynal MPC，123-20D）和瓊脂糖購(gòu)于Invitrogen，克隆連接載體pGEMR-T Easy購(gòu)于Promega，轉(zhuǎn)化用的大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞及其它生化試劑購(gòu)于TaKaRa，所需接頭、引物及探針均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 利用基因組提取試劑盒（Tiangen），按照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)云南松幼嫩新鮮針葉進(jìn)行基因組DNA提取。

1.2.2 接頭制備 采用SuperSNX接頭，序列為：SuperSNX-F：5'-GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGAATC -3'；SuperSNX-R：5'-pGATTCTGCTAGCTAGGCCTTAAACAAAA-3'。

將SuperSNX-F（100 μmol/L）和SuperSNX-R（100 μmol/L）各1.4 μL，再加入NaCl（0.5 mol/L）1.4 μL以及ddH2O 2.8 μL，將該混合物7 μL快速混勻，在PCR儀上95℃，5 min，關(guān)機(jī)緩慢冷卻至室溫，即制成雙鏈接頭。

1.2.3 基因組DNA的酶切及與接頭的連接 用RsaⅠ限制性?xún)?nèi)切酶消化基因組DNA，同時(shí)加入XmnⅠ酶防止接頭發(fā)生自連，1.5%瓊脂糖檢測(cè)。

酶切片段在T4連接酶的作用下加上雙鏈接頭，混勻，16℃過(guò)夜。以SuperSNX-F為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)連接反應(yīng)，反應(yīng)體系為25 μL，包括 10×PCR Buffer 2.50 μL，100×BSA 2.50 μL，10 mmol/L dNTPs 1.50 μL，25 mmol/L MgCl22.00 μL，100 μmol/L SuperSNX-F 1.30 μL，5 U/μLTaq酶0.20 μL，連接產(chǎn)物模板2.00 μL，ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃ 2 min，95℃ 2 min；95℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 90 s，25個(gè)循環(huán)；15℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖檢測(cè)。

1.2.4 磁珠富集法分離微衛(wèi)星 用于磁珠親和捕捉的微衛(wèi)星探針為：（AG）12、（AT）12、（CG）12、（GT）12、（ACG）12、（ACT）12和（CCA）8， 分 別在其3'端標(biāo)記上生物素，用這些微衛(wèi)星探針與連接產(chǎn)物進(jìn)行雜交，按Dynabeads鏈霉親和素磁珠M-280試劑盒操作指南，捕捉含微衛(wèi)星的DNA片段，洗脫掉其它非雜交片段。對(duì)富集雜交產(chǎn)物PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL，包括10×PCR Buffer 2.50 μL，100×BSA0.62 μL，10 mmol/L dNTPs 1.38 μL，25 mmol/L MgCl22.00 μL，100 μmol/L SuperSNX-F 1.30 μL，5 U/μLTaq酶0.20 μL，連接產(chǎn)物模板4.00 μL，ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 2 min；95℃20 s，60℃ 20 s，72℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 30 min，15℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖檢測(cè)。

1.2.5 富集文庫(kù)構(gòu)建與鑒定 將富集獲得的富含微衛(wèi)星DNA片段與pGEMR-T Easy載體相連接，再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞JM109建立微衛(wèi)星富集文庫(kù)。涂布于含有IPTG、X-Gal和氨芐青霉素的LB平板上，37℃上培養(yǎng)10-16 h。富集文庫(kù)中的陽(yáng)性克隆采用PCR篩選，以M13+/M13-為引物，LB平板上挑選的

陽(yáng)性菌落為模板，反應(yīng)體系為20 μL，包括10×PCR Buffer 2.50 μL，10 mmol/L dNTPs 0.50 μL，25 mmol/L MgCl22.00 μL，10 pmol/L M13+/M13-各1.00 μL，5 U/μLTaq酶0.20 μL，模板2.00 μL，ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 8 min，15℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖檢測(cè)［9］。

對(duì)PCR檢測(cè)到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析以鑒定文庫(kù)中微衛(wèi)星DNA 的富集效率。對(duì)序列去除載體后用SSRHunter進(jìn)行微衛(wèi)星的查找［10］。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA提取

提取的基因組DNA如圖1所示，瓊脂瓊脂糖檢測(cè)顯示，基因組比較完整，無(wú)明顯降解，濃度和純度均較高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 云南松基因組DNA

2.2 基因組酶切

用RsaⅠ限制性?xún)?nèi)切酶消化基因組DNA，酶切產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖檢測(cè)，結(jié)果如圖2。從圖2可知，大部分酶切片段集中在300-1 000 bp之間，說(shuō)明DNA已被酶切，滿足構(gòu)建云南松基因組微衛(wèi)星富集文庫(kù)的需要。

圖2 云南松基因組RsaⅠ酶切

2.3 酶切片段與接頭的PCR檢測(cè)

酶切片段在聚合酶的作用下與人工雙鏈接頭連接，對(duì)連接的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.0%瓊脂糖檢測(cè)，結(jié)果如圖3。片段在500-1 000 bp均勻彌散分布，DNA酶切片段和接頭連接成功，得到的產(chǎn)物可用于構(gòu)建云南松基因組微衛(wèi)星富集文庫(kù)。

圖3 接頭連接產(chǎn)物PCR擴(kuò)增

2.4 雜交富集產(chǎn)物檢測(cè)

雜交、富集后的產(chǎn)物為模板獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1.0%瓊脂糖檢測(cè)（圖4），片段主要分布于300-1 000 bp之間，富集效果較好。

圖4 云南松微衛(wèi)星富集片段PCR擴(kuò)增

2.5 微衛(wèi)星富集文庫(kù)構(gòu)建及鑒定

以富集反應(yīng)得到的DNA產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與載體連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，獲得微衛(wèi)星富集文庫(kù)。從微衛(wèi)星富集文庫(kù)中隨機(jī)挑取白色陽(yáng)性菌落，PCR擴(kuò)增檢測(cè)菌落的插入片段，篩選可能含有微衛(wèi)星片段的陽(yáng)

性克隆，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖檢測(cè)，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 云南松微衛(wèi)星富集文庫(kù)陽(yáng)性克隆PCR鑒定

有一條擴(kuò)增帶的即為插入片段全長(zhǎng)帶，該克隆內(nèi)可能含有微衛(wèi)星插入片段。從圖5可以看出，從左往右，泳道1、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、22、24中有擴(kuò)增條帶，均有可能含有微衛(wèi)星插入片段。在383個(gè)陽(yáng)性菌落中，257個(gè)菌落獲得PCR擴(kuò)增條帶，插入片段在400-1 000 bp之間，即PCR檢測(cè)陽(yáng)性率為67.10%。

2.6 克隆測(cè)序

對(duì)含PCR擴(kuò)增條帶的257個(gè)重組克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，在159條已獲得的序列中，有143條含有重復(fù)次數(shù)不少于3次的微衛(wèi)星序列，PCR檢測(cè)篩選的微衛(wèi)星序列效率為55.64%（143/257），富集效率為37.34%（143/383）。獲得的序列去除載體序列后，采用SSRHunter軟件進(jìn)行SSR的搜索。搜索后的序列，按Weber的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)把微衛(wèi)星序列劃分為完美型（Perfect）、非完美型（Imperfect）和復(fù)合型（Compound）3類(lèi)；將測(cè)序得到的143條微衛(wèi)星序列進(jìn)行分類(lèi)，其中完美型94條（65.73%）、非完美型34條（23.78%）和復(fù)合型15條（10.49%），部分序列的重復(fù)序列和側(cè)翼序列結(jié)果表1。

3 討論

微衛(wèi)星標(biāo)記可以通過(guò)基因組分離、數(shù)據(jù)庫(kù)序列信息以及近緣種的轉(zhuǎn)移等方面獲得。傳統(tǒng)微衛(wèi)星的分離是先構(gòu)建基因組文庫(kù)，然后選擇合適的探針對(duì)基因組文庫(kù)進(jìn)行掃描，這一過(guò)程需要大量的人力和時(shí)間。為避免傳統(tǒng)分離微衛(wèi)星方法中進(jìn)行基因組文庫(kù)的構(gòu)建和掃描，研究者相繼提出一些改進(jìn)的方法，如起初的在隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA方法［11］的基礎(chǔ)上改進(jìn)以擴(kuò)增未知的微衛(wèi)星，通過(guò)重復(fù)錨定隨機(jī)引物［12］或RAPD引物擴(kuò)增，隨后用微衛(wèi)星探針對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行Southern雜交［13，14］，此外還有陽(yáng)性選擇性克?。?5］、RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和陣列克隆等［16］，這些方法很快就取代傳統(tǒng)耗時(shí)耗力建庫(kù)和掃描的方法［17］，與此同時(shí)，也有采用引物延伸來(lái)構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫(kù)，較早采用這種方法分離微衛(wèi)星的是AC富集文庫(kù)，陽(yáng)性克隆得率40%-50%［18］，甚至高達(dá)100%［19］，但步驟繁瑣，沒(méi)有得到很好的應(yīng)用［17］。與這些方法相比，磁珠富集法是先雜交富集再建庫(kù)，省去了建立較大的基因組文庫(kù)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行大量篩選工作，具有周期短、操作簡(jiǎn)便、目的性強(qiáng)、陽(yáng)性克隆率高、一次可獲得大量的微衛(wèi)星序列等優(yōu)點(diǎn)［20］。經(jīng)陽(yáng)性菌落的挑選、擴(kuò)增、測(cè)序分析，PCR檢測(cè)篩選的微衛(wèi)星序列效率為55.64%（143/257），富集效率為37.34%（143/383），相比較而言，傳統(tǒng)方法在植物中的陽(yáng)性克隆比例僅為0.059%-5.8%，平均2.3%［17］。此外，本研究PCR檢測(cè)準(zhǔn)確率高達(dá)89.94%（143/159），與采用含有SSR的序列為引物的方法PIMA（PCR-based isolation of microsatellite arrays）相差無(wú)幾。鄧欣等［9］研究報(bào)道，從104個(gè)克隆測(cè)序分析中得到97個(gè)含有微衛(wèi)星序列，篩選的微衛(wèi)星序列準(zhǔn)確率達(dá)到93.27%。說(shuō)明利用磁珠富集

法進(jìn)行云南松微衛(wèi)星文庫(kù)的構(gòu)建是高效、可行的。經(jīng)測(cè)序分析，在143條含有SSR的序列中，完美型占65.73%，非完美型占23.78%，混合型占10.49%。Winter等［21］研究認(rèn)為，在真核生物基因組中，一般完美型比例要顯著高于非完美型，本研究與該規(guī)律相符。

表1 云南松部分微衛(wèi)星重復(fù)序列及其側(cè)翼序列

磁珠富集法涉及到高質(zhì)量基因組DNA的獲得、酶切消化、連頭與酶切片段DNA的連接、連接產(chǎn)物的富集、載體連接克隆等步驟，各個(gè)過(guò)程是連續(xù)且相互依存的，較關(guān)鍵的一步是磁珠富集的效率和特異性［9］，不含SSR的DNA也被吸附到磁珠表面形成非專(zhuān)一性吸附［22］，直接影響微衛(wèi)星序列獲得的效率。對(duì)不同的探針長(zhǎng)度、雜交條件和洗脫條件報(bào)道較多，然而利用這些條件對(duì)微衛(wèi)星富集效率的影響開(kāi)展調(diào)查分析較少［17］。起初Kandpal等［23］對(duì)洗脫時(shí)的溫度提出一定的標(biāo)準(zhǔn)，以盡可能地洗掉非專(zhuān)一性吸附的多余片段，僅保留富含微衛(wèi)星序列的目的片段。Gao等［20］研究報(bào)道將雜交溫度和首次洗滌溫度提高到60℃可基本消除非專(zhuān)一性吸附的現(xiàn)象。鄧欣等［9］在花生的微衛(wèi)星分離中，將雜交溫度和首次洗滌溫度提高到68℃，取得了較滿意的效果。本研究中將該溫度提高到66℃，也獲得比較好的結(jié)果。因此，不同物種SSR富集文庫(kù)構(gòu)建時(shí)，其富集的條件可能不一樣，富集過(guò)程雜交和洗滌的溫度需要進(jìn)行比較和優(yōu)化。

4 結(jié)論

采用磁珠富集法進(jìn)行云南松基因組微衛(wèi)星文庫(kù)的富集，在隨機(jī)挑選的383個(gè)陽(yáng)性克隆中，有257個(gè)菌落含有擴(kuò)增條帶；在獲得的159條序列中，有143條含有SSR，其中完美型占65.73%，非完美型占23.78%，混合型占10.49%。磁珠富集法構(gòu)建云南松基因組微衛(wèi)星文庫(kù)高效、可行。

［1］ 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志［M］. 第7卷.北京：科學(xué)出版社, 1978：211-282.

［2］ 金振洲, 彭鑒.云南松［M］.昆明：云南科技出版社, 2004：6, 21, 332.

［3］ Sehgal D, Raina SN. DNA markers and germplasm resource diagnostics：new perspectives in crop improvement and conservation strategies［M］//Arya ID, Arya S. Utilization of biotechnology in plant sciences. Meerut, India：Arya Rastogi Press, 2009：39-54.

［4］ Varshney RK, Graner A, Sorrells ME. Genic microsatellite markers in plants：features and applications［J］. Trends Biotechnol, 2005, 23（1）：48-55.

［5］ Kalia RK, Rai MK, Kalia S, et al. Microsatellite markers：an overview of the recent progress in plants［J］. Euphytica, 2011, 177（3）：309-334.

［6］ Weber JL, May PE. Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction［J］. The American Journal of Human Genetics, 1989, 44（3）：388-396.

［7］ Powell W, Machray GC, Provan J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats［J］. Trends in Plant Science, 1996, 1（7）：215-222.

［8］ Glenn TC, Schable NA. Isolating microsatellite DNA loci［J］. Methods in Enzymology, 2005, 395：202-222.

［9］ 鄧欣, 陳信波, 龍松華, 等.用磁珠富集法分離亞麻基因組微衛(wèi)星分子標(biāo)記［J］.作物學(xué)報(bào), 2008, 34（12）：2099-2105.

［10］ Weber JL. Informativeness of human（dC-dA）n·（dG-dT）npolymorphisms［J］. Genomics, 1990, 7（4）：524-530.

［11］ Williams JG, Kubelik AR, Livak KJ, et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］. Nucleic Acids Research, 1990, 18（22）：6531-6535.

［12］ Wu K, Jones R, Danneberger L, Scolnik PA. Detection of microsatellite polymorphisms without cloning［J］. Nucleic Acids Research, 1994, 22：3257-3258.

［13］ Cifarelli RA, Gallitelli M, Cellini F. Random amplified hybridization microsatellites（RAHM）：isolation of a new class of microsatellite-containing DNA clones［J］. Nucleic Acids Research, 1995, 23（18）：3802-3803.

［14］ Richardson T, Cato S, Ramser J, Ket al. Hybridization of microsatellites to RAPD：a new source of polymorphic markers［J］. Nucleic Acids Research, 1995, 23（18）, 3798-3799.

［15］ Ender A, Schwenk K, Stadler T, et al. RAPD identification of microsatellites in Daphnia［J］. Molecular Ecology, 1996, 5（3）：437-441.

［16］ Lunt DH, Hutchinson WF, Carvalho GR. An efficient method for PCR-based isolation of microsatellite arrays（PIMA）［J］. Molecular Ecology, 1999, 8：891-894.

［17］ Zane L, Bargelloni L, Patarnello T. Strategies for microsatellite isolation：a review［J］. Mol Ecol, 2002, 11：1-16.

［18］ Ostrander EA, Jong PM, Rine J, Duyk G. Construction of smallinsert genomic DNA libraries highly enriched for microsatellite repeat sequences［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 1992, 89（8）：3419-3423.

［19］ Paetkau D. Microsatellites obtained using strand extension：An enrichment protocol［J］. Biotechniques, 1999, 26（4）, 690-692, 694-697.

［20］ Gao GQ, He GH, Li YR. Microsatellite enrichment from AFLP fragments by magnetic beads［J］. Acta Botanica Sinica, 2003, 45（11）：1266-1269.

［21］ Winter AK, Fredholm M, Thomsen PD. Variable（dG-dT）n.（dC-dA） n sequences in the porcine genome［J］. Genomics, 1992, 12（2）：281-288.

［22］ Refseth UH, Fangan BM, Jakobsen KS. Hybridization capture of microsatellite directly from genomic DNA［J］. Electrophoresis, 1997, 18：1519-1523.

［23］ Kandpal RP, Kandpal G, Weissman SM. Construction of libraries enriched for sequence repeats and jumping clones, and hybridization selection for region-specific markers［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 1994, 91（1）：88-92.

（責(zé)任編輯 李楠）

Construction of Microsatellite-enriched Library of Pinus yunnanensis

Xu Yulan1，2Zhang Ruili2Tian Bin2Cai Nianhui2Kang Xiangyang1Duan Anan2
（1. College of Biological Science and Technology of Beijing Forestry University，National Engineering Laboratory for Tree Breeding，Beijing Forestry University，Beijing 100083；2. Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China，State Forestry Administration，Southwest Forestry University，Kunming 650204）

Microsatellite-enriched libraries in Pinus yunnanensis were constructed using an enrichment method with biotin-labeled probes and streptavidin-coated magnetic beads.Genomic DNAs of P. yunnanensis were extracted and digested with restriction enzyme Rsa 1. Adapters were ligated to the end of restriction fragments. Ligated products were amplified by PCR with primers complementary to adapters. The PCR products were hybridized with biotin-labeled simple sequence repeat probes（AG）12, （AT）12, （CG）12, （GT）12, （ACG）12, （ACT）12and（CCA）8. The hybridized complex was caught by magnetic beads coated with streptavidin. The biotinylated hybrids were isolated on the magnetic particles according to the strong affinity between biotin and streptavidin. The selected DNAs were amplified by PCR with primers complementary to adapters and cloned into pMD-19T plasmid vector, and then transformed into E. coli JM109 hosts. SSR enriched genomic DNA library of P. yunnanensis was constructed. A total of 257 positive clones were selected by PCR from 383 transformants in the microsatellite-enriched library, and 143 clones were found to contain simple sequence repeats（SSR）among 159 sequences. Among them, 94（65.73%）were perfect repeat, 34 imperfect（23.78%）and 15（10.49%）compound repeat. The results indicated that the method was efficient to construct the microsatelliteenriched library of P. yunnanensis. The library will be useful for further research on the isolation of microsatellite markers and the analysis of genetic diversity. .

Pinus yunnanensis Enriched library Microsatellite

2013-07-17

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260191），云南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2010CD065），云南省省院省校教育合作咨詢(xún)共建重點(diǎn)學(xué)科（211015），云南省教育廳研究生項(xiàng)目（2012J052）

許玉蘭，女，副教授，博士研究生，研究方向：林木遺傳育種的研究；E-mail：xvyulan@163.com

康向陽(yáng)，男，博士，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向：林木遺傳育種的教學(xué)與研究；E-mail：kangxy@bjfu.edu.cn

段安安，男，博士，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向：林木遺傳育種的教學(xué)與研究；E-mail：duananan@gmail.com