煙臺(tái)黑豬SLA-I重鏈基因末端生物素修飾及表達(dá)

煙臺(tái)黑豬SLA-I重鏈基因末端生物素修飾及表達(dá)

劉筏 楊金剛 翟曉鑫 董宋鵬 高鳳山
（大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116622）

為構(gòu)建煙臺(tái)黑豬SLA-2重鏈基因偶合生物素化酶BirA底物肽（BirA substrate peptide，BSP）并研究其在pET-28a（+）中的表達(dá)，設(shè)計(jì)煙臺(tái)黑豬SLA-2-BSP復(fù)合基因引物，PCR擴(kuò)增煙臺(tái)黑豬SLA-2-YTH-BSP復(fù)合基因，并克隆至pMD 19-T Simple Vectorp，經(jīng)酶切鑒定后將SLA-2-YTH-BSP復(fù)合基因與表達(dá)系統(tǒng)pET-28a（+）鏈接，并轉(zhuǎn)化到BL21（Rosseta）菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白。表達(dá)蛋白經(jīng)過(guò)Ni-NTA親和純化，并經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純化效果。PCR結(jié)果顯示SLA-2-BSP大小為900 bp，并成功克隆到pMD 19-T Simple Vector，酶切鑒定大小為876 bp，該基因鏈接到 pET-28a（+）并轉(zhuǎn)化到BL21（Rosseta）菌，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的大小為32.4 kD。目的蛋白以包涵體形式存在，純化后蛋白純度達(dá)到90%以上。成功構(gòu)建煙臺(tái)黑豬SLA-I重鏈偶合生物素化酶BirA底物肽（BSP）的pET-28a（+）的重組表達(dá)系，為下一步的SLA-I類(lèi)分子四聚體研究鑒定基礎(chǔ)。

煙臺(tái)黑豬 SLA-2 重鏈基因 生物素化酶BirA底物肽 純化

四聚體技術(shù)是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，其核心技術(shù)就是在主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex，MHC）I類(lèi)分子重鏈末端進(jìn)行生物素修飾，以結(jié)合親和素構(gòu)建四聚體檢測(cè)病毒CTL（cytotoxic T lymphocyte）表位，從而放大MHC I-peptide的檢測(cè)信號(hào)，有利于精確檢測(cè)病毒的CTL表位［1］。目前，國(guó)內(nèi)外分別構(gòu)建了人［2］、鼠［3］、雞［4］等MHC I類(lèi)分子四聚體，并篩選或證實(shí)了多種病毒

CTL表位。然而，目前關(guān)于豬MHC I四聚體鏈構(gòu)建鮮有報(bào)道。豬的MHC I類(lèi)分子也稱(chēng)為豬白細(xì)胞抗原（Swine leukocyte antigen，SLA）I類(lèi)分子。課題組最近報(bào)道了我國(guó)荷包豬SLA-I末端生物素化的研究，并在pET-21成功進(jìn)行了表達(dá)，從而開(kāi)始了我國(guó)地方品系豬SLA-I重鏈生物素修飾及表達(dá)的研究［5］。由于我國(guó)有豐富的地方品系豬資源，有必要開(kāi)展其他地方品系豬SLA-I的相關(guān)研究。煙臺(tái)黑豬是我國(guó)山東省煙臺(tái)地區(qū)的優(yōu)質(zhì)地方品系豬［6］，其重鏈SLA-I基因已經(jīng)克隆，并具有特征性［7］。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，以國(guó)內(nèi)品系煙臺(tái)黑豬SLA-I類(lèi)分子SLA-2功能基因?yàn)檠芯繉?duì)象，采用分子克隆和基因工程手段在體外構(gòu)建我國(guó)地方品系豬SLA-2偶合生物素化酶BirA底物肽的重組表達(dá)系，并在原核表達(dá)系統(tǒng)pET-28a（+）進(jìn)行表達(dá)和純化，為下一步構(gòu)建SLA-I/肽復(fù)合物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

重組質(zhì)粒SLA-2-YTH01/ pMD 18-T為大連大學(xué)分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，克隆載體 pMD 19-T Simple Vector，表達(dá)載體pET-28a（+）及菌株Escherichia coli.BL21（Rosseta）來(lái)自于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；Escherichia coliTop10菌株為大連大學(xué)分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

低分子量蛋白Marker、DL2000 DNA Marker、NdeI、XhoI和DNA純化試劑盒購(gòu)于大連寶生物公司；IPTG、胰化蛋白胨、甘氨酸酵母提取物、丙烯酰胺氨芐青霉素、過(guò)硫酸胺、二甲基甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、三羥甲基氨基甲烷等購(gòu)自上海生工。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì) 煙臺(tái)黑豬SLA-I重鏈分子SLA-2四聚體鏈表達(dá)引物設(shè)計(jì)PS-21F：5'-GGAATTCCATA TGGGCCCGCATTCCCTGAGCTATTTC-3'（下劃線部分為NdeI酶切位點(diǎn)）；P21BSPR：5'-AGTCTCGAGTTAACGATGATTCCACACCATTTTCTGTGCATCCAGAATAT GATGCAGGCTGCCGTCCCATCTCAGGGTGAGGGGC-3'（下劃線部分為XhoI酶切位點(diǎn)，斜體部分為BSP序列）。

1.2.2 SLA-2-YTH-BSP 亞克隆 以重組質(zhì)粒為模板，以PS-21F/P21BSPR為引物對(duì)，擴(kuò)增基因鏈SLA-2-YTH-BSP，PCR條件為94℃，5 min；94℃，30 s；56℃，45 s；72℃，90 s；30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，PCR結(jié)束后進(jìn)行核酸電泳，瓊脂糖凝膠濃度為1.0 %，電泳結(jié)束后在凝膠成像儀下檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后用DNA膠回收試劑盒回收目的片段。

回收之后SLA-2-YTH-BSP 產(chǎn)物連接 pMD19-T Simple并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。按照堿裂解法提質(zhì)粒，酶切篩選陽(yáng)性克隆并保存菌種，陽(yáng)性克隆送到生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建 將篩選的陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒，經(jīng)NdeI、XhoI雙酶切，凝膠純化回收SLA-2-YTHBSP 基因 。將 SLA-2-BSP 與 pET-28a連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21（Rosseta），涂布到含有卡那霉素的平板中，在37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，挑選菌落接種至LB培養(yǎng)基（含卡那），從培養(yǎng)的菌液中提取質(zhì)粒，經(jīng)NdeI、XhoI雙酶切篩選陽(yáng)性質(zhì)粒，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pET-28a（+）/SLA-2-YTH-BSP，見(jiàn)圖1，并送生物公司測(cè)序。

圖1 構(gòu)建pET-28a（+）/SLA-2-YTH-BSP重組質(zhì)粒

1.2.4 SDS-PAGE檢測(cè)SLA-2-YTH-BSP蛋白表達(dá)將陽(yáng)性重組菌 100 μL接種5 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)直至OD600在0.4-0.6之

間。加入1 mol / L IPTG 5 μL，誘導(dǎo)5 h后，取菌液1 mL，12 000 r/min，2 min，去上清，菌體經(jīng)TE溶解并經(jīng)5×SDS樣品buffer處理，SDS-PAGE測(cè)蛋白表達(dá)［8］。

1.2.5 SLA-2-YTH-BSP 蛋白純化 SLA-2-YTH-BSP表達(dá)蛋白按照文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行［9］。表達(dá)后的SLA-2-YTH-BSP重組菌（Rosseta）按 1%比例接種后擴(kuò)大培養(yǎng)，IPTG 誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，5 000 r/min，4℃離心收集細(xì)胞并洗滌后，冰浴超聲裂解細(xì)胞，高速離心后分別取上清和沉淀進(jìn)行 SDS-PAGE，檢測(cè)重組蛋白表達(dá)形式。收集包涵體并用 1% Triton X-100洗滌后，用 8 mol/L 尿素溶解，離心收集上清液，透析過(guò)夜后，進(jìn)行 Ni-NTA 親和層析，用 60 mmol/L 咪唑充分洗去雜蛋白后，用 0.3 mol/L 咪唑洗脫目標(biāo)融合蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)純化蛋白。

2 結(jié)果

2.1 SLA-2-YTP-BSP鏈的PCR擴(kuò)增

經(jīng)PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到一條約900 bp的條帶，與理論設(shè)計(jì)值898 bp大小相符，見(jiàn)圖2。

圖2 SLA-2-YTH-BSP的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 SLA-2-YTP-BSP鏈亞克隆到pMD-19-T Simple Vector

經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后，挑取單菌落培養(yǎng)，用NdeI、XhoI雙酶切，電泳顯示插入片段約900 bp，與目的片段876 bp相符合，見(jiàn)圖3。

圖3 pMD-19-T Simple Vector/SLA-2-YTP-BSP重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.3 SLA-2-YTP-BSP鏈亞克隆到pET-28a（+）

將與pMD 19-T Simple載體鏈接的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切，回收后與 pET-28a（+）連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21（Rosseta），經(jīng)雙酶切鑒定發(fā)現(xiàn)插入片段大小為870 bp左右，與理論值876 bp相符，見(jiàn)圖4。

圖4 重組質(zhì)粒pET-28a（+）/SLA-2-YTH-BSP雙酶切鑒定

2.4 序列分析pET-28（+）/SLA-2-YTH-BSP

經(jīng)序列測(cè)定分析，pET-28（+）/SLA-2-YTH-BSP與原序列100%同源，另外，序列末端含有BSP序列部分，見(jiàn)圖5。

2.5 SDS-PAGE分析pET-28（+）/SLA-2-YTH-BSP中的表達(dá)

將經(jīng)鑒定陽(yáng)性的重組表達(dá)菌加入IPTG至1 mmol/L，然后再誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h，SDS-PAGE檢測(cè)目的基因的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組菌誘導(dǎo)后，與對(duì)照相比表達(dá)出約30 kD的條帶，與理論值32.4 kD相符，而且相對(duì)表達(dá)含量達(dá)到40%以上，見(jiàn)圖6。

2.5 SLA-2-YTH-BSP蛋白純化

SLA-2-YTH-BSP超聲裂解后，檢測(cè)主要以包涵體形式存在，包涵體經(jīng)過(guò) Ni-NTA柱純化，SDSPAGE檢測(cè)，結(jié)果（圖7）顯示純化后的蛋白大小約為30 kD，與全菌表達(dá)蛋白大小一致。另外，蛋白的純度達(dá)到90%以上，符合進(jìn)行下一步蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究的要求。

3 討論

本項(xiàng)目前期研究中，已經(jīng)成功克隆了煙臺(tái)黑

豬SLA-I類(lèi)分子功能基因SLA-2，并已經(jīng)在DDBJ/ EMBL/GenBank注冊(cè)，獲得序列號(hào)AB672508，為進(jìn)行本研究奠定了基礎(chǔ)［6］。經(jīng)分析，所克隆煙臺(tái)黑豬SLA-2共1 119 bp，其中75-896位屬于胞外區(qū)，編碼274個(gè)氨基酸殘基（本研究為了提高SLA-2胞外區(qū)結(jié)合多肽的延展性，實(shí)際表達(dá)了275個(gè)氨基酸）。SLA-2抗原多肽結(jié)合區(qū)結(jié)合抗原多肽后在細(xì)胞表面與CD8+T淋巴細(xì)胞的T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）結(jié)合，形成MHC I-peptide-TCR復(fù)合物。為了增加在體外檢測(cè)的信號(hào)，需要借助生物素-親和素結(jié)合原理構(gòu)建MHC I四聚體［10］。為此，需要在SLA-2胞外區(qū)末端加含有17個(gè)氨基酸的生物素化酶BirA底物肽（BirA substrate peptide）［11］，以結(jié)合生物素，而一分子親和素能結(jié)合4分子的生物素，從而形成SLA I-peptide四聚體。四聚體主要用于檢測(cè)

SLA I限制性的抗原多肽或TCR。需要指出的是，本研究中PCR擴(kuò)增SLA-2-YTH-BSP的序列長(zhǎng)度為898 bp，是包含了酶切位點(diǎn)和末端的保護(hù)性堿基，而酶切后插入片段的長(zhǎng)度為876 bp。盡管PCR產(chǎn)物可以直接酶切，與pET-28a（+）連接，但連接的成功率一般不高。為了增加連接的成功率，采用先把插入片段克隆入克隆載體pMD 19-T simple的方法，經(jīng)大量擴(kuò)增后，再將酶切回收后的插入片段連接入pET-28a（+），經(jīng)酶切后，顯示插入片段存在，證明連接成功。但圖中載體質(zhì)粒顯示有兩條DNA帶，其中下面的條帶應(yīng)當(dāng)為未酶切完全的重組質(zhì)粒，可能是酶量不足或質(zhì)粒不純所致，但并不影響主要結(jié)果。

圖5 SLA-2-YTH-BSP序列

圖6 SDS-PAGE分析pET-28（+）/SLA-2-YTH-BSP中的表達(dá)

圖7 SLA-2-YTH-BSP蛋白純化

本研究中采用pET-28a（+）載體，是由于嘗試了其他表達(dá)載體后，發(fā)現(xiàn)pET-28a（+）更適合SLA-2-YTH-BSP的表達(dá)。前期研究中曾報(bào)道了我國(guó)另一地方品系豬荷包豬重鏈基因偶合底物肽及表達(dá)研究，其中用到了另一表達(dá)載體pET-21a（+）［5］，二者具有相同的酶切位點(diǎn)NdeI和XhoI，不同的是pET-21a表達(dá)的外源基因不攜帶任何非相關(guān)序列，而pET-28a（+）表達(dá)的外源基因會(huì)在5'端攜帶6個(gè)His的標(biāo)簽，從而便于親和純化。本研究中經(jīng)過(guò)SLA-2-YTH-BSP與pET-28a（+）重組后轉(zhuǎn)化Escherichia coli.BL21（Rosseta），經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后表達(dá)蛋白大小為32 kD，與之前報(bào)道的大小一致［5］。另外，重組表達(dá)質(zhì)粒不僅經(jīng)過(guò)酶切鑒定，也經(jīng)過(guò)了測(cè)序，序列分析結(jié)果表明插入序列與設(shè)計(jì)的SLA-2-YTH-BSP完全一致。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)含量達(dá)到了40%以上，可以用于今后四聚體構(gòu)建等需要大量表達(dá)蛋白的相關(guān)研究。另外，由于pET-28a（+）載體多克隆位點(diǎn)上游帶有His標(biāo)簽，因此可以利用Ni-NTA進(jìn)行親和純化。本研究中，重組蛋白SLA-2-YTH-BSP主要以包涵體形式存在，說(shuō)明表達(dá)蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。收集包涵體蛋白，經(jīng)過(guò)Ni-NTA親和純化，蛋白純度達(dá)到了90%以上，可以用于今后進(jìn)一步的蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究。

4 結(jié)論

構(gòu)建了煙臺(tái)黑豬SLA-I重鏈基因末端生物素修飾的重組表達(dá)載體，并獲得表達(dá)蛋白，為進(jìn)一步構(gòu)建SLA-I-肽復(fù)合物，并展開(kāi)四聚體研究奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Biotinylated the Carboxyl Terminal of Heavy Chain of SLA-I from Yantai Black Pig and Its Expression

Liu Fa Yang Jingang Zhai Xiaoxin Dong Songpeng Gao Fengshan
（College of Life Science and Technology，Dalian University，Dalian 116622）

To construct the heavy chain of SLA-2 conjugated with the BirA substrate peptide（BSP）and express the recombinant genes in pET-28a（+）for Yantai Black Pig（YTH）, a pair of primers to express the recombinant SLA-2-YTH-BSP was designed and the recombinant SLA-2-YTH-BSP was amplified by PCR followed by sub-cloning the gene into pMD19-T Simple Vector. After identification by cleavage with Nde I and Xho I, the SLA-2-YTH-BSP was ligated to pET-28a（+）and the recombinant plasmids was transformed into BL21（Rosseta）to be induced to express followed by analysis of the expressing products by SDS-PAGE. The expressed interest of protein was purified by Ni-NTA column and detected by SDS-PAGE. The PCR results showed that the length of nucleotides of SLA-2-YTH-BSP was about 900 bp which was consistent with the calculated value. Then, the SLA-2-YTH-BSP with 876 bp was successfully inserted into the pMD-19-T Simple Vector identified by cleavage with Nde I and Xho I, and then the genes were inserted into pET-28a（+）and transformed into Escherichia coli BL21（Rosseta）. After induction, SLA-2-YTH-BSP was successfully expressed with the interest of protein about 32.4 kD. After purification, the purity of the interest of the inclusion protein reached to 90%. It was concluded that the recombinant expressing system containing SLA-2 conjugated with BSP in pET-28a（+）was successfully constructed and the research would pave the base to construct tetramer in SLA class I.

Yantai black pig SLA-2 Heavy chain gene BirA substrate peptide Purification

2013-09-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31172304），遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（201311258009），大連大學(xué)本科生創(chuàng)新項(xiàng)目（2012029）

劉筏，女，研究方向：動(dòng)物分子免疫學(xué)；E-mail：729652171@qq.com

高鳳山，男，副教授，博士，研究方向：基因工程和動(dòng)物分子免疫學(xué)；E-mail：gfsh0626@126.com