李云霄 紀 霞 高俊杰 (青島市市立醫(yī)院 青島市常見病重點實驗室哮喘病實驗室，青島 266071)

哮喘和代謝綜合征均是威脅人類健康的常見病和多發(fā)病，近年來哮喘合并代謝綜合征的發(fā)病也受到關(guān)注。瘦素(Leptin，LEP)和瘦素受體(Leptin receptor，LEPR)是肥胖相關(guān)的主要因素，LEP 作為一種多效應(yīng)性細胞因子在大量炎癥應(yīng)答中發(fā)揮作用，其功能主要通過LEPR 介導(dǎo)。本研究通過病例對照分析來研究LEP 基因-2548A/G 和LEPR 基因Glu223Arg 位點多態(tài)性與哮喘和代謝綜合征易感性之間的關(guān)系?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇2012 年3 月～2013 年1 月在青島市市立醫(yī)院門診或住院的哮喘合并代謝綜合征病人(A+M)82 例，單純哮喘病人(AS)114 例，單純代謝綜合征病人(MS)100 例和健康對照(NC)48例，哮喘病人符合《GINA》中的診斷標準，代謝綜合征符合2005 國際糖尿病聯(lián)盟MS 全球共識定義，正常對照組近期無呼吸道及胃腸道感染史，無心、肝或腎病史，一級親屬中無2 型糖尿病、肥胖、高血壓、高脂血癥及其他代謝性疾病，各組間性別比率及年齡間比較均無差異(P ＞0.05)，一般情況見表1。

1.2 方法

1.2.1 模板DNA 制備 所有入選者過夜禁食12 h，次晨空腹抽取4 ml 外周靜脈血EDTA 抗凝，應(yīng)用美國Promega 公司DNA 提取試劑盒，從PBMC 中提取基因組DNA，定量后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物合成 根據(jù)Genebank 中提供的基因組序列設(shè)計PCR 引物，瘦素上游引物序列:5'-TTTCCTGTAATTTTCCCGTGAG-3'，下游引物序列:5'-AAAGCAAAGACAGGCATAAAAA-3'，瘦素受體上游引物序列:5'-ACCCTTTAAGCTGGGTGTCCCAAATAG-3'，下游引物序列:5'-AGCTAGCAAATATTT TTGTAAGCAATT-3'，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 DNA 擴增 PCR 反應(yīng)體系25 μl，包括模板DNA 100 ng，上下游引物各1 μl，10 × 緩沖液2.5 μl，dNTPs 1 μmol/L，Taq DNA 聚合酶0.75 U，MgCl21.5 μl(25 mmol/L)，加雙蒸水至25 μl，試劑均有Fermentas 公司提供。應(yīng)用Labnet 全自動PCR 擴增儀，反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸90 s，30 個循環(huán)，最后72℃終末延伸8 min。

1.2.4 PCR 產(chǎn)物驗證 產(chǎn)物驗證取PCR 產(chǎn)物5 μl經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后在培清JS-780A 全自動凝膠成像分析儀下觀察結(jié)果并照相，出現(xiàn)相應(yīng)條帶則證明PCR 成功，可用于以下實驗。

1.2.5 限制性核酸內(nèi)切酶酶切(Restriction fragment length polymorphism，RFLP) 酶切體系共20 μl，包括:LEP 用HhaⅠ(Fast)1 μl，LEPR 用Msp I(Fast)1 μl(內(nèi)切酶由Fermentas 公司提供)，F(xiàn)ast Buffer 2 μl，PCR 產(chǎn)物17 μl。酶切條件為:37℃，5 min。酶切產(chǎn)物置入3%瓊脂糖凝膠(EB 染色)，電壓100 V電泳60 min，與Marker(50 bp)對比，使用美國Biorad 凝膠成像系統(tǒng)觀察酶切后的產(chǎn)物長度并拍照保存，見圖1、2。

1.2.6 基因多態(tài)性判斷 在瘦素基因5'端啟動子區(qū)2 548 位核苷酸存在G-A 多態(tài)性，當2 548 位為G等位基因時，存在限制性內(nèi)切酶酶切位點，而當此位為A 等位基因時，無限制性內(nèi)切酶酶切位點。因此，當瘦素基因型為GG 時，兩個等位基因均有切點，酶切產(chǎn)物電泳后有兩條帶(181、61 bp);當基因型為AA 時，兩個等位基因均無酶切位點，酶切產(chǎn)物電泳后為一條帶(242 bp);當基因型為AG 時，一個等位基因有酶切位點，另一個等位基因無酶切位點，酶切產(chǎn)物電泳后為三條帶(242、181 和6l bp)，因61 bp 很小，在酶切后電泳過程中易丟失。

在瘦素受體基因外顯子6 翻譯區(qū)第668 位核苷酸存在A-G 變異(即Gln223Arg 多態(tài)性)，當668 位為A 等位基因時，存在限制性內(nèi)切酶酶切位點，而當此位為G 等位基因時，無限制性內(nèi)切酶酶切位點。因此，當瘦素基因型為AA 時，兩個等位基因均有切點，酶切產(chǎn)物電泳后有兩條帶(293、128 bp);當基因型為GG 時，兩個等位基因均無酶切位點，酶切產(chǎn)物電泳后為一條帶(421 bp);當基因型為AG 時，一個等位基因有酶切位點，另一個等位基因無酶切位點，酶切產(chǎn)物電泳后為三條帶(421、293 和128 bp)。

1.3 統(tǒng)計學處理 計算各組瘦素基因-2548A/G、瘦素受體基因Gln223Arg 位點基因型頻率及等位基因頻率，并確認其是否符合Hardy Weinberg 平衡，各組基因型頻率及等位基因頻率比較用χ2檢驗。以上數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較 各組間性別、年齡比較均無差異(P ＞0.05)，而對于BMI、SBP、DBP、TG、TC、LDLC、FPG、HDL-C，代謝綜合征和哮喘合并代謝綜合征組與正常對照組和哮喘組相比有顯著差異(P 均＜0.05)，見表1。

2.2 遺傳平衡檢驗 對所有研究對象進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗，該位點基因型和等位基因頻率符合Hardy-Weinberg 平衡(P ＞0.05)，都來自同一群體。

2.3 瘦素基因-2548A/G 和瘦素受體基因Gln223Arg位點多態(tài)性的頻率分布 在96 例正常成人中，瘦素基因-2548A/G 的AA 及AG +GG 基因型頻率分別為0.625和0.375，A 及G 的等位基因頻率分別為0.792 和0.208。瘦素受體基因Gln223Arg 的GG 和AG+AA 基因型頻率分別為0.792 和0.208，G 及A 的等位基因頻率分別為0.896 和0.104，見表2。

表1 各組臨床和實驗室指標(±s)Tab.1 Clinical and laboratory parameters of each group(±s)

表1 各組臨床和實驗室指標(±s)Tab.1 Clinical and laboratory parameters of each group(±s)

Note:M.F.Female;A+M.Asthma-combined Metabolic syndrome;AS.Asthma;MS.Metabolic syndrome;NC.Normal control;BMI.Body mass index;SBP.Systolic blood pressure;1 mmHg=0.133 kPa;DBP.Diastolic blood pressure;TG.Triglyceride;TC.Total cholesterol;HDL-C.High-density lipoprotein-cholesterol;LDL-C.Low-density lipoprotein-cholesterol;FPG.Fast insulin;1):vs CN group，P ＜0.05;2):vs asthma group P ＜0.05.

表2 各組瘦素基因G2548A 和瘦素受體基因Gln223Arg 基因型和等位基因分布頻率(%)Tab.2 Frequency distribution of leptin gene promoter region G2548A and LEPR Gln223Arg genotypes and alleles in every groups(%)

表3 各組瘦素-G2548A 和瘦素受體Gln223Arg 基因型及等位基因兩兩比較Tab.3 Comparison of LEP-G2548A genotype and allele and LEPR Gln223Arg genotype and allele between each group

圖1 瘦素基因-G2548A 位點PCR-RFLP 圖譜Fig.1 PCR-RFLP patterns of leptin gene -G2548A

圖2 瘦素基因Gln223Arg 位點PCR-RFLP 圖譜Fig.2 PCR-RFLP patterns of LEPR gene Gln223Arg

2.4 瘦素基因-2548A/G 和瘦素受體基因Gln223Arg 位點多態(tài)性與哮喘和代謝綜合征的關(guān)系

2.4.1 瘦素基因-2548A/G 位點多態(tài)性 各組之間瘦素基因-2548A/G 位點基因頻率比較見表2。MS和A+M 組AA 基因型頻率與NC 相比顯著升高(P=0.047 和0.038)，AS 與NC 無差異，其余各組間也無差異。繼而對哮喘進行嚴重程度分組后發(fā)現(xiàn)，輕度AS 與NC 無差別，但中重度AS 的AA 基因型頻率與NC 相比顯著升高(P=0.019 和0.036)，見表2、3。

2.4.2 瘦素受體Gln223Arg 位點多態(tài)性 各組之間瘦素受體基因Gln223Arg 位點基因頻率比較見表2。MS 的AG+AA 基因型與NC 和AS 相比顯著升高(P=0.037 和0)，A+M 的AG+AA 基因型和AS相比有升高趨勢(P=0.059)，沒有發(fā)現(xiàn)AS 與NC間的差異，對AS 嚴重程度分組后也沒有發(fā)現(xiàn)與NC的差異，見表2、3。

2.5 瘦素基因-2548A/G 和瘦素受體基因Gln-223Arg 位點等位基因與哮喘和代謝綜合征的關(guān)系

2.5.1 瘦素基因-2548A/G 位點多態(tài)性 MS 和A+M 的A 等位基因頻率與NC 相比顯著升高(P=0.046 和0.044)，在對哮喘進一步嚴重程度分組后發(fā)現(xiàn)，中重度AS 的A 等位基因頻率與NC 相比也升高(P=0.028 和0.041)，見表2、3。

2.5.2 瘦素受體基因Gln223Arg 位點多態(tài)性 MS的A 等位基因頻率與NC 和AS 相比有顯著差異(P=0.023 和0)，A +M 的A 等位基因頻率與AS相比也有顯著差異(P=0.032)，在對哮喘嚴重程度分組后未發(fā)現(xiàn)與正常組有差異，見表2、3。

3 討論

瘦素為脂肪組織分泌的激素，通過與瘦素受體(LEPR)結(jié)合，發(fā)揮抑制食欲、減少熱量攝取和脂肪堆積及提高機體代謝率的功能。有學者［1］已經(jīng)越來越認識到瘦素在代謝疾病中的重要作用，并提出了“瘦素抵抗”學說。瘦素也被認為可以獨立預(yù)報哮喘的發(fā)病和炎癥［2］。有報道指出瘦素上調(diào)免疫反應(yīng)，增強CD4+T 細胞、肥大細胞和巨噬細胞的增殖吞噬作用以及單核細胞的增殖［2-7］，不同程度地增加TH1 細胞因子(TNF-α、IL-6、IFN-γ)的產(chǎn)生，減少TH2 細胞因子(IL-5、IL-4、IL-10)的產(chǎn)生，增加氣道平滑肌血管內(nèi)皮生長因子的釋放［8］，這些與肥胖或哮喘有關(guān)。瘦素受體屬于Ⅰ類細胞因子家族，基因位于1 號染色體，由20 個外顯子和19 個內(nèi)含子組成。瘦素與受體結(jié)合后，可使受體形成二聚體并磷酸化，通過多種信號途徑發(fā)揮效應(yīng)。瘦素受體激活JAK-STAT3 通路、致敏反應(yīng)細胞激酶、細胞因子信號肽-3 抑制劑(SOCS-3)和COX［9］。人類氣道平滑肌細胞表達瘦素受體，瘦素通過調(diào)節(jié)瘦素受體亞型來抑制血管平滑肌細胞的增長［10］。

3.1 瘦素基因-2548A/G 我們的研究顯示，MS 和A+M 的AA 基因型頻率顯著升高(P=0.047、0.038)，A 等位基因頻率升高(P=0.046、0.044)，有研究表明，瘦素基因-2548A/G 多態(tài)性與原發(fā)性高尿酸血癥(HUM)密切相關(guān)，A 等位基因可能是HUM 發(fā)病的遺傳易感因素，冠心病病人-2548 位點A 等位基因的頻率高于健康人［10，11］，這與我們的研究結(jié)果相似。Szczepankiewicz［12］在哮喘研究中發(fā)現(xiàn)，瘦素基因-2548 位點多態(tài)性與哮喘相關(guān)，哮喘病人AA 基因型和A 等位基因顯著高于正常組，GG 基因型是正常者的保護基因。也有研究表明哮喘組瘦素基因-2548 位點A 等位基因頻率明顯高于健康對照組［13］。雖然我們的研究沒有發(fā)現(xiàn)哮喘患者瘦素基因-2548 位點AA 基因型或A 等位基因與正常人不同，但在進行哮喘嚴重程度分組后發(fā)現(xiàn)，中重度哮喘AA 基因型和A 等位基因頻率比正常組升高(P=0.019 和0.036)，從結(jié)果可以推論:瘦素基因-2548 位點多態(tài)性可能是代謝綜合征的致病因素，也可能與哮喘的嚴重性相關(guān)，參與中重度哮喘發(fā)病，這可能是兩種疾病存在關(guān)系的基因基礎(chǔ)，但其具體致病機制還需進一步研究。

3.2 瘦素受體Gln223Arg 1996 年NC sidine等［14］首次報道，LEPR 基 因Gln223Arg 存在變異。LEPR 基因Gln223Arg 變異與肥胖、2 型糖尿病、高血壓、血脂紊亂等密切相關(guān)，且A 等位基因攜帶者發(fā)生代謝紊亂更加嚴重，發(fā)生MS 的風險更高。Chagnon［15］在魁北克人群中的研究提示GIn223Arg 多態(tài)性與體質(zhì)量指數(shù)、皮褶厚度和體內(nèi)脂肪含量等有關(guān)，Guizar-Mendoza 等［16］發(fā)現(xiàn)GIn223Arg 位點多態(tài)性與心臟交感神經(jīng)活性、體脂百分比等有關(guān)。而Heo［17］未發(fā)現(xiàn)瘦素受體基因GIn223Arg 多態(tài)性與體質(zhì)量指數(shù)或腰圍相關(guān)。在我國的研究中，陳海翎［18］等發(fā)現(xiàn)攜帶A 等位基因者發(fā)生MS 的風險是G 等位基因的3.302倍。我們的研究發(fā)現(xiàn)，MS 比NC 的AG +AA 基因型比例高(P=0.037)，A 等位基因比例也高(P=0.023)，這與之前學者的研究是一致的。Szczepankiewicz［12］的 研 究 中 并 沒 有 發(fā) 現(xiàn)Gln223Arg位點多態(tài)性與哮喘有關(guān)，而且至今沒有研究證明此基因多態(tài)性是否與漢族人哮喘有關(guān)。我們的研究也沒有發(fā)現(xiàn)Gln223Arg 的多態(tài)性與哮喘有關(guān)，但我們發(fā)現(xiàn):MS 比AS 的AG+AA 基因型頻率顯著升高(P=0)，A 等位基因也顯著升高(P=0)，而A +M 與NC 相比A 等位基因頻率沒有差異，卻與AS 有顯著差異(P=0.032)。這提示，A 等位基因可能有對抗哮喘發(fā)病的傾向性作用，但卻是MS 的致病基因，當AS 合并MS 時，兩個相反作用會中和一部分，便沒有表現(xiàn)出A+M與NC 的差異，但A 等位基因是否為哮喘的保護基因還需進一步進行研究。這也證明，AS 和MS可能只是兩種疾病的共病狀態(tài)，不存在LEPR 基因方面的共同致病作用，但因為之前沒有類似的報道，我們的結(jié)果也沒有比較。在對哮喘進行分級后也沒有發(fā)現(xiàn)與LEPR 基因的相關(guān)性，說明LEPR 基因?qū)ο瓏乐爻潭炔]有作用。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)瘦素基因-2548A/G 和瘦素受體基因Gln223Arg 位點多態(tài)性均與哮喘和代謝綜合征有一定的相關(guān)性，瘦素基因-2548 A/G 中A 等位基因可能是代謝綜合征的致病基因，而且可能導(dǎo)致嚴重的哮喘表型;瘦素受體基因Gln223Arg A 等位基因可能是代謝綜合征的致病基因，卻沒有發(fā)現(xiàn)其與哮喘的相關(guān)性，同時，從這兩個基因的角度來看，代謝綜合征與哮喘可能是兩種疾病的共病狀態(tài)，之間不存在相對應(yīng)的致病關(guān)系。通過檢測基因型，可以篩查哮喘和代謝綜合征的易患人群及判斷哮喘的嚴重程度，對及早發(fā)現(xiàn)和及時預(yù)防有重要意義。

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