劉丹丹 俞秋霞 張慧娟 姜曉艷 (哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內分泌科，哈爾濱 150001)

2 型糖尿病與脂代謝異常關系密切［1］。胰島素抵抗貫穿2 型糖尿病發(fā)展的始終。2 型糖尿病患者多伴有游離脂肪酸升高。高游離脂肪酸與胰島素抵抗和B 細胞功能損傷有密切關系。G 蛋白偶聯受體120(G protein-coupled receptor 120，GPR120)為中長鏈脂肪酸的受體，推測其與影響糖代謝的胰島素信號通路有關。葡萄糖轉運蛋白4(Glucose transporter 4，GLUT4)是胰島素敏感的靶組織主要的胞膜轉運蛋白，它的表達和功能的改變可能涉及肌肉和脂肪細胞胰島素抵抗。本研究分析脂肪細胞中脂肪酸受體GPR120 與GLUT4 的關系，進而揭示其與胰島素抵抗的關系，為研發(fā)治療糖尿病藥物提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 3T3-L1 細胞培養(yǎng) 3T3-L1 細胞購于中國科學院細胞庫。用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件培養(yǎng)3T3-Ll 細胞，待細胞匯合度達70%～80%時，把siRNA-GPR120 轉入細胞，24 h 后(此時記為第0 天)，換為誘導培養(yǎng)基Ⅰ［DMEM+10%FBS+0.5 mmol/L isobutylmethylxanthine，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)(Sigma)+10 μg/ml 胰島素(Ins)(Sigma)+1.0 μmol/L 地塞米松(Dex)(Sigma)］，第2 天換為誘導培養(yǎng)基Ⅱ［DMEM +10 μg/ml 胰島素(Ins)+10% FBS］培養(yǎng)2 d，第4 天換成含10%FBS，軟脂酸(PA)(Sigma)0.5 mmol/L 的DMEM 培養(yǎng)24 h，第5 天換成含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)，以后每2 d換液1 次。

1.2 GPR120 siRNA 轉染 靶向小鼠(GPR120)基因mRNA(NM_181748.2)熒光標記的siRNA 寡核苷酸由上海吉瑪公司化學合成，siRNA 寡核苷酸序列(GPR120-siRNA)如下所示，靶向mRNA 的位點為:1116-1134，Sense:5'-GUGCAUGUAAAGGGAGUUATT-3';Antisense:5'-UAACUCCCUUUACAUGCACTT-3'。陰性對照:Sense 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3' Antisense 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。siRNA 陰性對照寡核苷酸(Negative control siRNA 或NC-siRNA)購自上海吉瑪公司。待3T3-L1 細胞生長至70%～80%時，進行轉染實驗。把siRNA-GPR120 轉入細胞，40 μg siRNA 溶于160 μl的DEPC 水中。然后按照X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent 的說明書進行轉染。轉染效果用Real-time PCR 測定。

1.3 油紅O 染色 取轉染siRNA 后誘導分化第8天的細胞，棄去培養(yǎng)液經PBS 洗3 次后，10%的福爾馬林固定液固定30 min，PBS 洗2 次，油紅O 工作液(0.5 g 油紅O 粉末溶于100 ml 98%的異丙醇)染色8 min，60%異丙醇分色10～20 s，蒸餾水沖洗。顯微鏡下觀察。

1.4 Real-Time PCR siRNA 轉染3T3-L1 細胞后24 h，細胞誘導分化，第4 天0.5 mmol/L 軟脂酸(PA)孵育24 h 后，向PA 處理后的細胞中加人胰島素使終濃度為100 nmol/L，37℃孵育15 min。第5天提取3T3-L1 細胞RNA(Omega 試劑盒)。RNA 反轉錄成cDNA(TaKaRa PrimeScriptTMRT-PCR Kit)，然后按照 LightCycler480 SYBR Green I Master(Roche)說明書進行。各基因引物如下:β-actin:R 5'-TACGACCAGAGGCATACAGGGACAA-3' ;F 5'-ACCAACTGGGACGATATGGAGAAGA-3'。GPR120:R 5'-CTCGGATCTGGTGGCTCTCA-3';F 5'-GATTGGCCCAACCGCATAG-3'。GLUT4 引物如參考文獻［2］Gyeong-Min DO 所描述的。

1.5 Western blot 3T3-L1 細胞按照如上所述轉染誘導脂肪酸處理后，第5 天收集細胞，SDS-PAGE 膠電泳(分離膠15%，濃縮膠5%)，電泳完畢后進行轉膜，轉膜條件100 mA 60 min。轉膜完畢后應用5%脫脂奶粉封閉20 min，15 ml PBST 洗滌1 次，5 min。GPR120 Antibody，GLUT4 antibodies (R＆D Systems，USA)β-actin antibodies (Lab Vision，USA)按1 ∶1 000 稀釋，Western 信號增強劑(HaiGene，M2501)處理2 h，用10 ml Rapid WB buffer 孵育預處理的一抗40 min。PBST 洗滌1 次，5 min。向10 ml Rapid WB buffer 中加入HRP 標記二抗反應20 min，二抗按1∶10 000 稀釋。二抗孵育結束后，PBST洗滌3 次，每次5 min。2 ml 增強型ECL 顯色液(HaiGene，M2301)進行暗室曝光至膠片，曝光30 s。

2 結果

2.1 誘導3T3-L1 細胞分化導致GPR120 mRNA 表達 提取誘導前及誘導分化后第5 天的3T3-L1 細胞總RNA，用RT-PCR 方法檢測其中GPR120 mRNA的表達，結果顯示，正常3T3-L1 細胞中不表達GPR120 mRNA，誘導分化第5 天后可檢測到GPR120 mRNA 表達(P ＜0.05，圖1)。

2.2 干擾GPR120 導致脂質減少 3T3-L1 細胞轉染熒光標記的GPR120-siRNA 后，在藍色激光下可見視野中布滿顯現綠色熒光的物質(圖2)。轉染NC-siRNA 的細胞，誘導后第8 天油紅O 染色發(fā)現很多細胞內充滿紅色的脂滴，脂滴圍繞細胞核排列，一些小脂滴融合成較大的脂滴(圖3 A)。而轉染GPR120-siRNA 的細胞脂滴數量明顯變少，體積明顯變小(圖3B)。

圖1 3T3-L1 細胞誘導分化過程中GPR120 mRNA 水平增加Fig.1 Level of GPR120 mRNA was increased through induced differentiation in 3T3-L1 cells

圖2 熒光標記的siRNA 的高轉染效率(×50)Fig.2 High transfection efficiency of fluorescence labeled siRNA(×50)

圖3 3T3-L1 細胞油紅O 染色(×200)Fig.3 Oil O red staining of 3T3-L1 cells(×200)

圖4 Real-time PCR 檢測轉染NC-siRNA 和GPR120-siRNA 的3T3-L1 細胞中GPR120 與GLUT4 mRNA 表達水平變化Fig.4 3T3-L1 cells transfected with NC-siRNA or GPR120-siRNA were subjected to real-time PCR for GPR120 and GLUT4 mRNA levels

圖5 Western blot 檢測轉染NC-siRNA 和GPR120-siRNA 的3T3-L1 細胞中GPR120 與GLUT4 蛋白表達水平變化Fig.5 3T3-L1 cells transfected with NC-siRNA or GPR120-siRNA were subjected to Western blot for GPR120 and GLUT4 protein levels

2.3 干擾GPR120 導致GLUT4 表達減少 NC-siRNA 和GPR120-siRNA 轉染3T3-L1 細胞，24 h 后對細胞進行誘導，3T3-L1 細胞誘導5 d 后，結果發(fā)現轉染GPR120-siRNA 的細胞GPR120 mRNA 和蛋白表達水平顯著減少(P ＜0.05)，另外GLUT4 mRNA 和蛋白的表達水平也明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.05，圖4 和圖5)。

3 討論

GPR120 作為長鏈FFA 的受體，在介導FFA 信號并改變脂肪細胞的分化和糖脂代謝效應等方面可能具有重要的作用。本實驗顯示，在3T3-L1 細胞誘導之前GPR120 不表達，誘導后第5 天可檢測到GPR120 的表達，可見GPR120 是隨著3T3-L1 細胞的分化而表達的。當GPR120 的表達下調后，3T3-L1 誘導后8 d 經油紅O 染色的細胞脂滴數量明顯變少，體積明顯變小。由此可推測GPR120 參與并影響3T3-L1 細胞的脂肪分化和代謝。

胰島素發(fā)揮生理作用是生物信號發(fā)出、轉導與實現的過程［3-5］，胰島素信號傳導障礙是胰島素抵抗的重要形成因素［6-8］。肌細胞和脂肪細胞在胰島素刺激下攝取葡萄糖主要通過GLUT4。基礎狀態(tài)時細胞表面GLUT4 很少，但在胰島素刺激下，通過INS-IRS-PI-3K-GLUT4 通路，觸發(fā)含GLUT4 的囊泡以胞吐形式向細胞表面轉位。

本實驗選擇的軟脂酸為含16 個碳的飽和脂肪酸，為GPR120 的配體。根據Yi 等［9］報道，5 mmol/L PA 孵育脂肪細胞24 h 可以誘導胰島素抵抗的發(fā)生。胰島素抵抗發(fā)生時，GLUT4 向細胞表面的轉位減少。有研究顯示，GLUT4 從細胞內特殊貯存囊泡中的選擇性丟失導致細胞內GLUT4 的減少，引起GLUT4 轉位減少，并可能成為2 型糖尿病的發(fā)病機制。本實驗中采用siRNA 技術下調GPR120 在3T3-L1 細胞中的表達后，高濃度PA 刺激下3T3-L1 細胞中胰島素信號通路中關鍵蛋白GLUT4 表達水平較陰性對照組明顯減少。GLUT4 的減少必然影響其向細胞膜的轉位，而GLUT4 轉位的減少必然影響葡萄糖的轉運。因此我們可以推測GPR120 通過影響胰島素信號通路中GLUT4 的表達水平，進一步影響了葡萄糖的代謝。進一步推測GPR120 參與了或加重了胰島素抵抗的發(fā)生。

［1］Griffin ME，Marcucci MJ，Cline GW，et al.Free fatty acid-induced insulin resistance is associated with activation of protein kinase C theta and alterations in the insulin signaling cascade［J］.Diabetes，1999，48(6):1270-1274.

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