張憶雄 胡 燕 郭萌萌 朱順飛 陶弋婧 趙娟娟 周 涯 鄭 靜 徐 林

(遵義醫(yī)學院免疫學教研室暨貴州省免疫學研究生教育創(chuàng)新基地，遵義 563000)

腸系膜淋巴結(Mesenteric lymph nodes，MLNs)是腸相關淋巴組織的重要組成部分，也是腸道局部免疫應答誘導的初始部位。腸系膜淋巴結中淋巴細胞的比例和數量可反映局部黏膜免疫防御功能的完善程度，而其淋巴細胞組成異常與多種疾病的發(fā)生密切相關［1］。如腸系膜淋巴結Th1/Th17 細胞比例異常將導致炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)等自身免疫性疾病的發(fā)生［2］。

MicroRNA-126(miR-126)是miRNAs 家族中重要的一員，位于EGFL7 基因7 號內含子中，其在血管和心臟、肺等組織器官的內皮細胞中高表達［3］。新近大量研究報道m(xù)iR-126 與免疫細胞的功能相關。Okuyama 等［4］發(fā)現(xiàn)miR-126 可調控B 細胞前體細胞的功能。Agudo 等［5］報道m(xù)iR-126 可通過VEGFR2 軸調控漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cells，pDCs)的功能，參與病毒等微生物引發(fā)的固有免疫應答。此外，我們課題組新近也發(fā)現(xiàn)miR-126 可通過PI3K/AKT 調控CD4+CD25+調節(jié)性T 細胞的外周誘導［6］，提示其在機體免疫應答中具有重要調控作用。然而，miR-126 與腸系膜淋巴結免疫細胞組成的相關關系至今仍未有研究報道。本研究中擬利用miR-126 基因敲減小鼠模型，初步探討miR-126 敲減后對腸系膜淋巴結T 及B 淋巴細胞比例的影響，以期為深入探討miR-126 在固有免疫應答中的作用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級雌性FVB 小鼠和miR-126KD 小鼠(廣州賽業(yè)生物科技有限公司);蘇木精-伊紅(HE)染色液(泰康醫(yī)療);流式細胞儀(Beckman Coulter);熒光顯微鏡(Olympus);R-Phycoerythrin(PE)anti-mouse CD19，R-Phycoerythrin (PE)antimouse CD3、R-Phycoerythrin (PE)anti-mouse CD4 及Allophycocyanin (APC) anti-mouse CD8 (Ebioscience)。

1.2 方法

1.2.1 miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結重量和細胞數目的檢測 取出miR-126KD 小鼠和WT 小鼠腸系膜淋巴結，稱取重量后制成石蠟切片備用;另一部分用玻片的糙面輕輕研磨成單細胞懸液，用細胞計數板計數。

1.2.2 HE 染色檢測腸系膜淋巴結的形態(tài)學改變 石蠟切片HE 染色，顯微鏡下觀察腸系膜淋巴結的病理形態(tài)學改變。

1.2.3 流式細胞術(FACS)檢測腸系膜淋巴結淋巴細胞比例的變化 取出miR-126KD 小鼠和WT 小鼠腸系膜淋巴結后，置于冰上，用玻片的糙面輕輕研磨成單細胞懸液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，1 200 r/min 10 min 離心，棄掉上清液，分別加入CD19-PE、CD3-PE、CD4-PE 和CD8-APC 熒光標記抗體各1 μl，4℃避光孵育30 min，PBS 洗滌2 遍，F(xiàn)ACS檢測。

1.2.4 采用GraphPad PrismTM統(tǒng)計軟件，數據以±s 表示，組間比較采用兩獨立樣本資料的t 檢驗，P ＜0.05 認為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結的重量和細胞總數的變化 WT 小鼠和miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結形態(tài)及大小如圖1A 所示，與WT 小鼠組相比，miR-126KD 組的淋巴結體積明顯增大;miR-126KD組淋巴結重量也顯著增加，且細胞總數明顯增加，具有統(tǒng)計學差異(圖1B、C，P ＜0.05)。

2.2 miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結病理形態(tài)學的改變 HE 染色結果如圖2 所示，低倍鏡下可見miR-126KD 組淺層皮質區(qū)淋巴小結增生(圖2A、B)，在高倍鏡下還可見副皮質區(qū)淋巴細胞明顯增加(圖2E、F)。

2.3 miR-126KD 小鼠中腸系膜淋巴結CD19+B細胞及CD3+T 細胞的百分數變化 FACS 檢測結果如圖3 所示，WT 小鼠和miR-126KD 小鼠MLNs 中CD19+B 細胞及CD3+T 細胞百分率均無明顯變化。

圖1 miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結重量和細胞總數的變化Fig.1 Change on weight and total cells number in miR-126KD mice

圖2 miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結病理形態(tài)學觀察(HE 染色)Fig.2 Pathologic morphology of mesenteric lymph nodes in miR-126KD mice (HE staining)

圖3 WT 小鼠和miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結CD19 +B 細胞及CD3 + T 細胞百分數的比較Fig.3 Comparison of CD19 + B cells and CD3 + T cells in WT mice and miR-126KD mice

圖4 WT 小鼠和miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結CD4 + T細胞及CD8 + T 細胞百分數的變化Fig.4 Change on proportion of CD4 + T cells and CD8 +T cells in WT mice and miR-126KD mice

圖5 WT 小鼠和miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結CD19 +B 細胞、CD4 + T 細胞和CD8 + T 細胞數量的變化Fig.5 Change on counts of CD19 + B cells，CD4 + T cells and CD8 + T cells in WT mice and miR-126KD mice

2.4 miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結CD4+T 細胞及CD8+T 細胞的百分數變化 我們進一步用FACS 檢測CD4+T 細胞及CD8+T 細胞的百分數。如圖4A 所示，該小鼠腸系膜淋巴結CD4+T 細胞百分數明顯減少，而CD8+T 細胞百分數顯著增加(圖4B，P ＜0.05)。

2.5 miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結CD19+B 細胞、CD4+T 細胞和CD8+T 細胞數量的變化 最后，我們統(tǒng)計了miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結CD19+B細胞、CD4+T 細胞和CD8+T 細胞的數量。如圖5 所示，CD19+B 細胞和CD4+T 細胞數量無明顯差異，而CD8+T 細胞數量顯著增加(圖5，P ＜0.05)。

3 討論

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是新近發(fā)現(xiàn)的一類由內源基因編碼的參與基因轉錄后水平調控的長約19～22 個核苷酸的非編碼蛋白質的單鏈RNA，其在胚胎發(fā)育、細胞增殖和細胞凋亡等一系列生命進程中發(fā)揮了重要的調控作用［7］。越來越多的研究表明，miRNAs 在調控免疫應答的過程中起了重要的作用，并與免疫細胞的發(fā)育分化密切相關。如，新近Kang 等［8］報道m(xù)iR-17-92 家族可通過phIpp2 調控Tfh 細胞的分化;Gracias 等［9］則報道m(xù)iR-155 過表達可增強CD8+T 細胞抗病毒應答;此外，miR-10a 可通過Bcl-6 調控Th 細胞的可塑性分化［10］。然而，有關miRNAs 對黏膜免疫組織，如腸系膜淋巴結的作用的研究較少。

本研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)miR-126KD 小鼠的腸系膜淋巴結體積、重量和細胞總數均顯著增加。進一步的檢測顯示miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結中，CD19+B 細胞、CD3+T 細胞比例無明顯變化，提示miR-126 敲減后不會顯著影響B(tài) 細胞和T 細胞的組成變化。然而，有意義的是，我們發(fā)現(xiàn)腸系膜淋巴結中CD8+T 細胞的比例和數量均顯著增加，而CD4+T 細胞的比例則明顯減少，數量無差異，提示miR-126 可能對不同T 淋巴細胞亞群的影響具有差異性。類似地，Rao 等［11］報道m(xù)iR-34a 敲減后，骨髓中B 淋巴細胞明顯增加;Henao 等［12］則報道，miR-181 敲除后，胸腺NKT 細胞比例顯著減少;此外，Kohlhaas 等［13］還報道，miR-155 敲除后，脾和腸系膜淋巴結調節(jié)性T 細胞比例和數量均顯著下降。這些研究提示，特定的miRNAs 分子可能在不同的免疫器官和免疫細胞中發(fā)揮了不同的調控作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結中淋巴小結增生，副皮質區(qū)淋巴細胞增加，提示miR-126 還可能影響腸系膜淋巴結中淋巴細胞的分布，然而具體機制仍待闡明。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)miR-126 敲減后小鼠中腸系膜淋巴結T 淋巴細胞的變化，這為后續(xù)深入探討miR-126 在特定免疫器官和免疫細胞生物學功能中的作用提供了重要的前期實驗依據。

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