韋棟,張欣欣

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院臨床病毒研究室，上海 200025

呼吸道病毒主要包括流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)、腺病毒、鼻病毒等，目前其感染已成為全世界主要致死性因素之一。不論是在發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家，每年因呼吸道病毒感染而占用的醫(yī)療資源增加了政府的沉重負(fù)擔(dān)[1]。世界衛(wèi)生組織(World Health Orgnization，WHO)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，20世紀(jì)僅流感病毒便奪去了全世界1億人的生命，其中大部分是老人和兒童[2]。因此，如何在早期對(duì)呼吸道病毒感染作出準(zhǔn)確診斷一直是臨床面臨的難點(diǎn)。由于大多數(shù)呼吸道病毒感染表現(xiàn)出相似癥狀，臨床醫(yī)師很難僅根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)作出準(zhǔn)確診斷[3]。病毒分離培養(yǎng)是診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但獲得結(jié)果至少需3～5 d，難以對(duì)早期診斷和早期治療提供幫助。常用的快速檢測方法如免疫熒光分析(immunofluorescent assay, IFA)及酶免疫分析(enzyme immunoassay, EIA)雖有較高的特異度，但靈敏度不理想(利用抗體中和試驗(yàn)檢測H1N1感染的靈敏度只有50%左右)[4]。近幾年來，尤其是隨著幾種新型病毒﹝嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)、H5N1、H1N1、博卡病毒(bocavirus，BoV)等﹞被發(fā)現(xiàn)，人們迫切需要尋求一種更加快速、準(zhǔn)確的病毒檢測方法。

以聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)為代表的核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)在過去10年里飛速發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測，因此利用核酸檢測技術(shù)成為呼吸道病毒體外診斷的新方向[5]。核酸檢測技術(shù)在保證高靈敏度和特異度的基礎(chǔ)上，大大縮短了檢測時(shí)間，國際上圍繞其建立了多種較為成熟的呼吸道病毒檢測方法。本文就核酸檢測技術(shù)及其在目前常見呼吸道病毒感染中的相關(guān)應(yīng)用作一綜述。

1 現(xiàn)有核酸檢測技術(shù)

1.1 PCR

起源于1984年的PCR技術(shù)，為現(xiàn)代臨床分子檢測打下了基石。伴隨技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)PCR由于檢測時(shí)間過長、易污染、靈敏度及特異度不理想且無法準(zhǔn)確定量等原因，已逐漸被其衍生方法(如實(shí)時(shí)熒光定量PCR)所替代，在呼吸道病毒核酸檢測領(lǐng)域已不常用。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以傳統(tǒng)PCR技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，使核酸檢測從定性分析發(fā)展到定量分析，開創(chuàng)了核酸檢測分析的新局面。目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR已成為呼吸道病毒核酸檢測的最主要方法。

相對(duì)于傳統(tǒng)PCR，熒光定量PCR檢測呼吸道病毒有如下優(yōu)點(diǎn)：①定量檢測可隨時(shí)監(jiān)控病毒擴(kuò)增情況；②建立了一個(gè)封閉式反應(yīng)檢測環(huán)境，大大減少了交叉污染的可能性，同時(shí)具有很高的靈敏度及特異度[6]，且所需標(biāo)本量極??；③檢測時(shí)間較傳統(tǒng)PCR縮短。隨著技術(shù)發(fā)展，多重PCR可在一次反應(yīng)中同時(shí)檢測多個(gè)病原體甚至病毒亞型[7]，大大節(jié)約了成本及時(shí)間，但需特異性的反應(yīng)試劑和專門的檢測設(shè)備，因此很難在偏遠(yuǎn)地區(qū)和小型醫(yī)院普及。

1.3 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)(microarray technology)又稱基因微陣列，通過將已標(biāo)記的待測標(biāo)本與特異性排列的寡核苷酸序列雜交后，利用激光共聚焦收集雜交信號(hào)，從而完成對(duì)病原體的檢測。根據(jù)固定寡核苷酸序列載體性質(zhì)的不同，分為固相及液相芯片分析技術(shù)。利用固相基因芯片技術(shù)成功建立的呼吸道病毒檢測系統(tǒng)具有高通量特點(diǎn)，通過獲得病原體的全部信息可對(duì)病毒進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定和篩選，甚至發(fā)現(xiàn)新型病毒，這是傳統(tǒng)方法難以比擬的[8]。經(jīng)過多年發(fā)展，成熟商品化的固相芯片技術(shù)包括AutoGenomics的INFINITI Analyzer技術(shù)和Idaho Technology的FilmArray技術(shù)，兩者均可同時(shí)檢測15～17種呼吸道病毒[9,10]。

液相基因芯片技術(shù)的代表是Luminex公司所開發(fā)的微球懸浮陣列技術(shù)(又稱流式熒光檢測技術(shù))xMAP，基本原理是將特異性的基因探針與具有不同熒光信號(hào)的微球相交聯(lián)，待其與待測擴(kuò)增片段結(jié)合后，借助流式技術(shù)獲得相應(yīng)的病毒信息，達(dá)到快速、準(zhǔn)確定量分析。目前，Luminex的xTAG和Qiagen的ResPlexⅡ這2種商業(yè)化檢測技術(shù)已獲得美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)投入臨床使用，可在3 h內(nèi)檢測16～19種呼吸道病毒及其亞型[11]。

1.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

2000年，日本學(xué)者Notomi提出了一種全新的核酸擴(kuò)增技術(shù)——環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)。其借助3對(duì)特異性引物(涉及靶基因上6段不同的基因序列)進(jìn)行擴(kuò)增，在短時(shí)間內(nèi)即可獲得大量DNA擴(kuò)增片段[12]。由于具有6種引物，且必須在全部引物都結(jié)合于正確區(qū)域后擴(kuò)增才會(huì)進(jìn)行，因此LAMP具有極高的特異度；同時(shí)靈敏度達(dá)到PCR的10～100倍，病毒的最低檢測范圍可達(dá)0.01～10 PFU[10]。此外，LAMP擴(kuò)增只需保持65 ℃恒溫，省去了復(fù)雜的溫度控制設(shè)備及溫度調(diào)節(jié)過程，使檢測成本和時(shí)間均較PCR大幅下降。LAMP擴(kuò)增結(jié)果的觀察基本依靠產(chǎn)物的濁度分析。最便捷的方法是通過肉眼觀察擴(kuò)增管辨別陽性結(jié)果，也可在加入SYBR Green、鈣黃綠素(calcein)等染料后用紫外燈照射觀察結(jié)果，使用實(shí)時(shí)濁度儀(LA-200，Teramecs，Japan)則可對(duì)光密度(optical density，OD)值進(jìn)行半定量實(shí)時(shí)監(jiān)測[12]。

LAMP方法具有高特異度、高靈敏度、快速、低成本、無需特殊設(shè)備即可觀察結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，但引物設(shè)計(jì)復(fù)雜，其中2對(duì)長序列引物需達(dá)色譜純級(jí)別，且易被污染而影響檢測結(jié)果。但瑕不掩瑜，LAMP使得核酸診斷向床邊檢測(point-of-care testing，POCT)更進(jìn)了一步，十分適合基層快速診斷。

1.5 多重連接依賴的探針擴(kuò)增技術(shù)

多重連接依賴的探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)利用簡單的雜合、連接、PCR擴(kuò)增反應(yīng)，可對(duì)待測核酸靶序列進(jìn)行精確的定性和定量分析，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因診斷。MLPA最大的特色在于其針對(duì)靶序列設(shè)計(jì)了1對(duì)探針、1條化學(xué)合成的短探針及1條由M13噬菌體制備的長探針，擴(kuò)增僅針對(duì)完成連接的探針而非樣本靶序列。只有當(dāng)特異性探針與靶序列完全互補(bǔ)時(shí)，2條探針才能被連接酶連接形成單鏈擴(kuò)增，而每1對(duì)探針的擴(kuò)增產(chǎn)物長度都是唯一的，借助毛細(xì)電泳可對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離和鑒別，確保了其極高的特異度[13]。

目前歐洲已通過一種基于MLPA的檢測方法——RespiFinder assay，同時(shí)檢測包括流感病毒、副流感病毒、RSV、腺病毒在內(nèi)的15種呼吸道病毒，具有理想的靈敏度和特異度[14]。與其他分子診斷技術(shù)比較，MLPA較PCR和分離培養(yǎng)在靈敏度及特異度方面均有很大的優(yōu)勢，且操作簡單，重復(fù)性好，無需特殊設(shè)備，但在檢測時(shí)間方面優(yōu)勢不明顯，只能保證在24 h內(nèi)給出結(jié)果，無法作為快速診斷手段。

1.6 循環(huán)探針技術(shù)

循環(huán)探針技術(shù)(cycling probe technology)是一種高靈敏的核酸探針技術(shù)，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基礎(chǔ)上，巧妙地將DNA/RNA雜合探針與RNase H結(jié)合以達(dá)到檢測靶序列的目的[15]。循環(huán)探針是一種寡核苷酸，為DNA/RNA雜合體，其5′端為熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端是熒光淬滅基團(tuán)，內(nèi)部含有RNA堿基。當(dāng)探針完整時(shí)，可保持靜默狀態(tài)。在擴(kuò)增產(chǎn)物與探針互補(bǔ)結(jié)合后，RNase H會(huì)在探針RNA堿基處切斷探針，使熒光報(bào)告基團(tuán)釋放熒光信號(hào)。循環(huán)探針技術(shù)擁有很高的特異度，甚至能識(shí)別1個(gè)堿基的不同?；谶@一優(yōu)點(diǎn)，可用于研究單核苷酸多態(tài)性。

目前，有研究嘗試?yán)醚h(huán)探針技術(shù)檢測流感病毒耐藥株突變。與基因芯片等技術(shù)相比，循環(huán)探針技術(shù)更迅速，在保持了高特異度的基礎(chǔ)上大幅降低了成本，在流感耐藥株突變檢測方面有很高的實(shí)用性[16]。但目前未見其用于檢測其他病毒感染。

1.7 生物質(zhì)譜技術(shù)

近幾年來隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，越來越多的臨床實(shí)驗(yàn)室開始將質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于臨床檢測項(xiàng)目。在病原微生物檢測方面，具有極高分辨率的基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)無疑是一種有效的檢測手段。利用MALDI-TOF-MS對(duì)擴(kuò)增后的待測病毒PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，基于不同特異性核酸片段的差別，鑒別不同待測核酸序列的組成，再借助已有的病毒基因序列資料，可準(zhǔn)確鑒別出待測病原體[17]。

MALDI-TOF-MS的優(yōu)勢與潛力不言而喻，高度的分辨率與靈敏度、全自動(dòng)化的設(shè)備支持、隨著技術(shù)發(fā)展逐步縮短的檢測時(shí)間都是其亮點(diǎn)。目前，該方法可檢測的病毒種類也逐漸擴(kuò)展到RSV、副流感病毒、人類偏肺病毒(human metapneumovirus，HMPV)、冠狀病毒(coronavirus，CoV)、BoV等[17,18]。雖然其離真正成為常規(guī)檢測技術(shù)還需一段時(shí)間，但必將成為未來臨床實(shí)驗(yàn)室中病毒檢測的重要手段之一。

1.8 對(duì)未知呼吸道病毒的核酸檢測技術(shù)

呼吸道病毒的危險(xiǎn)性主要在于其暴發(fā)性及傳染性。2003年SARS暴發(fā)事件顯示，一種未知呼吸道病毒突然暴發(fā)所帶來的后果可能是災(zāi)難性的，因此如何在短時(shí)間內(nèi)更快、更準(zhǔn)確地檢測出新型病毒在臨床檢測中具有重要意義。由于現(xiàn)有的特異性免疫學(xué)及序列依賴的核酸檢測技術(shù)并不適用，研究者已開始建立非培養(yǎng)和非序列依賴的病原體檢測方法。常用技術(shù)包括非序列依賴的單引物擴(kuò)增技術(shù)(sequence-independent single primer amplification, SISPA)、隨機(jī)PCR技術(shù)(random PCR, rPCR)等。SISPA已用于檢測ssRNA病毒、dsRNA病毒及DNA病毒。rPCR通過在隨機(jī)引物的5′端添加一個(gè)通用序列后進(jìn)行2輪擴(kuò)增，具有比SISPA更高的檢測效率，已成功發(fā)現(xiàn)了新型BoV和CoV。最近，被稱為 次世代定序(next generation sequencing，NGS)[19]的具有高通量特征的序列分析檢測平臺(tái)也開始受到重視。相信隨著技術(shù)的不斷完善，快速、準(zhǔn)確鑒定新型病毒將不再是夢想。

2 應(yīng)用核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測呼吸道病毒

2.1 流感病毒

流感病毒是最常見的呼吸道病毒之一。A型流感病毒由于其血凝素(hemagglutinin，HA)基因及神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)基因極易發(fā)生基因漂移或重組，導(dǎo)致新型流感病毒暴發(fā)性感染，長期以來一直是全世界關(guān)注的一大公共衛(wèi)生問題。一般而言，流感病毒感染的典型臨床表現(xiàn)包括發(fā)熱、咳嗽、咽痛、鼻塞，以及頭痛、肌肉痛等，全年齡均可發(fā)病。由于許多呼吸道感染均可表現(xiàn)出流感樣癥狀，因此臨床醫(yī)師通常需借助實(shí)驗(yàn)室診斷來確診流感病毒感染。目前，我國流感病毒常用的病原學(xué)診斷方法包括血清學(xué)診斷和病毒培養(yǎng)，兩者靈敏度均較低。而臨床常用的2種抗流感病毒藥物——神經(jīng)氨酸酶抑制劑和M2離子通道抑制劑均須在患者感染后48 h內(nèi)用藥，這對(duì)流感病毒的病原學(xué)診斷提出了極高的要求。

核酸檢測技術(shù)為解決這一問題提供了新的途徑。自從1991年反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)首次成功用于檢測流感病毒以來， LAMP、核酸序列依賴性擴(kuò)增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)等多種分子檢測技術(shù)先后用于流感病毒的快速檢測。到目前為止，針對(duì)流感病毒的核酸檢測主要集中于3個(gè)靶基因序列，分別為M蛋白基因(M)、HA基因及非結(jié)構(gòu)蛋白基因(NSP)。一般而言，以保守M基因作為靶序列可檢測出所有A型流感病毒亞型。若希望對(duì)這些亞型進(jìn)行區(qū)分，則大多采用HA基因作為靶序列。在許多研究中，巢式PCR表現(xiàn)出較高的敏感度，但污染概率較高，故不宜作為臨床實(shí)驗(yàn)診斷的首選。

2.2 RSV

RSV是引發(fā)嬰幼兒支氣管炎及下呼吸道感染最重要的病原體之一[20]。RSV的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)通常包括病毒培養(yǎng)、免疫分析技術(shù)及核酸檢測。在核酸檢測中，一般以f、nc和polⅠ 基因作為靶序列[21, 22]。近幾年來隨著多重PCR技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了多種多重PCR方法，可準(zhǔn)確檢測RSV。以ResPlex Ⅱ(Qiagen, Germany)、Seeplex RV (Seegene, Korea)和xTAG RVP (Luminex, Canada)最具代表性，其中xTAG RVP首先通過美國FDA認(rèn)證，可同時(shí)檢測包括RSV在內(nèi)的12種呼吸道病毒。

值得一提的是，近年來部分研究開始嘗試將免疫PCR(immuno-PCR)技術(shù)應(yīng)用于RSV的實(shí)驗(yàn)室檢測[23]。免疫PCR將免疫檢測與核酸擴(kuò)增相結(jié)合，集PCR的高靈敏度及抗原抗體反應(yīng)的高特異度于一體。2011年一項(xiàng)研究顯示，使用免疫PCR檢測RSV可將最低檢測限降低至4 PFU/ml，達(dá)到一般RT-PCR靈敏度的4倍。但該技術(shù)目前尚未進(jìn)行臨床驗(yàn)證，其實(shí)際性能還有待商榷[24]。

2.3 腺病毒

腺病毒可導(dǎo)致發(fā)熱、咳嗽，同時(shí)可伴有咽喉炎、中耳炎、結(jié)膜炎、支氣管炎、哮喘和肺炎等癥狀。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在全部呼吸道感染中，1%～5%由腺病毒引發(fā)。對(duì)兒童而言，腺病毒導(dǎo)致呼吸道感染的比例攀升至2%～14%；尤其是幼年移植患者，腺病毒感染率可達(dá)22%，同時(shí)病死率達(dá)60%，因此有研究認(rèn)為應(yīng)將對(duì)腺病毒的定量PCR檢測作為兒科移植患者的重要監(jiān)測手段之一[25]。

目前，對(duì)腺病毒最靈敏的檢測技術(shù)為核酸檢測，適用的臨床標(biāo)本類型包括呼吸道、糞便、尿液及血液標(biāo)本。主要擴(kuò)增區(qū)域?yàn)楸Ｊ氐膆基因，也有將fiber或va(VA RNA)基因作為擴(kuò)增靶序列以達(dá)到進(jìn)一步分型的目的。以va基因?yàn)榘行蛄械腜CR檢測敏感度要高于以h基因?yàn)榘行蛄械臋z測方法。但無論如何，核酸擴(kuò)增檢測腺病毒的敏感度均優(yōu)于傳統(tǒng)的免疫分析或病毒培養(yǎng)技術(shù)。在多重PCR檢測領(lǐng)域，幾種主要的多重PCR方法均可檢測腺病毒，包括ResPlex Ⅱ、Seeplex RV 15、xTAG RVP等。2011年一項(xiàng)研究對(duì)750份呼吸道樣本進(jìn)行檢測，同時(shí)比較了4種不同的多重PCR檢測方法(ResPlex Ⅱ、Seeplex RV-15、xTAG RVP和xTAG RVP fast)[26]，結(jié)果顯示4種方法檢測腺病毒的敏感度差異很大(52.4%～100%)，其中Seeplex RV-15敏感度最高。當(dāng)然，敏感度的差異也有可能是由樣本抽選方法和腺病毒血清型不同導(dǎo)致的。

2.4 鼻病毒

長期以來，鼻病毒一直被認(rèn)為僅能引起普通感冒而未引起重視。但隨著核酸檢測技術(shù)的發(fā)展，越來越多的疾病被發(fā)現(xiàn)與鼻病毒相關(guān)。鼻病毒感染一般于每年春季及九月初達(dá)高峰，主要通過接觸和飛沫傳播。除普通感冒外，現(xiàn)已證明鼻病毒還與哮喘、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive lung disease，COPD)及嚴(yán)重的下呼吸道感染相關(guān)。其中人類鼻病毒遺傳群C(human rhinovirus species C，HRV-C)與哮喘和COPD的發(fā)病有十分密切的聯(lián)系[27,28]。

核酸檢測被認(rèn)為是最有效的實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)，通常以極度保守的5′-UTR區(qū)作為靶序列?，F(xiàn)已證明使用核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測鼻病毒的敏感度明顯高于傳統(tǒng)的病毒分離檢測。雖然以5′-UTR區(qū)作為檢測鼻病毒的靶序列最靈敏，但其無法將鼻病毒與人腸道病毒(human enterovirus，HEV)相區(qū)分[29]。這一缺陷可通過引入第2輪腸道病毒特異性PCR擴(kuò)增或以vp1/vp4基因作為靶序列來解決。在多重PCR領(lǐng)域，目前xTAG RVP檢測是唯一通過美國FDA認(rèn)證的、可用于檢測鼻病毒的多重PCR檢測方法。其他方法仍處于進(jìn)一步研究中，暫時(shí)無法確定其在鼻病毒檢測方面的臨床效果[30]。

2.5 H7N9禽流感病毒

H7N9禽流感病毒最初于2011年從禽類分離獲得，屬A型流感病毒[31]。但第1例人感染H7N9禽流感病毒病例于2013年2月在中國上海首先被發(fā)現(xiàn)，其后迅速波及中國多個(gè)省市，至2014年1月已累計(jì)出現(xiàn)200余例。臨床表現(xiàn)初期與普通流感相似，包括發(fā)熱、咳嗽、流涕、咽痛，伴頭痛或肌肉酸痛，可迅速進(jìn)展為重癥肺炎或呼吸衰竭。目前還未確定H7N9禽流感病毒的詳細(xì)傳播方式。

首例患者的H7N9禽流感病毒全長基因序列是借助“基因浮板跳躍”方法從原始患者標(biāo)本中分離獲得的，目前其最可靠的檢測方法是利用核酸檢測技術(shù)進(jìn)行病原學(xué)診斷[32]。檢測方法包括RT-PCR、LAMP等，檢測位點(diǎn)涵蓋M基因、HA基因及NA基因。部分研究證實(shí)，利用LAMP檢測H7N9禽流感病毒的特異度可達(dá)100%，敏感度亦高于普通RT-PCR，是一種非常有價(jià)值的快速篩查方法[33]。同時(shí)，也有研究人員基于對(duì)H7N9禽流感病毒的M基因建立了實(shí)時(shí)熒光RT-PCR快速篩查方法，但其實(shí)際臨床價(jià)值仍需進(jìn)一步研究[34]。加拿大的研究人員嘗試?yán)枚嘀豍CR檢測H7N9禽流感病毒，并與RT-PCR比較。結(jié)果表明，目前的主要多重PCR(ResPlex Ⅱ、xTAG RVP)在檢測H7N9禽流感病毒方面的敏感度及特異度均大大低于實(shí)時(shí)熒光RT-PCR[35]。因此，目前用多重PCR取代RT-PCR對(duì)H7N9禽流感病毒進(jìn)行篩查并不可取。

3 結(jié)語

分子診斷技術(shù)經(jīng)過多年發(fā)展，在不同原理的基礎(chǔ)上演變出多種病毒檢測技術(shù)。這些技術(shù)憑借快速、高敏感度、高特異度的優(yōu)勢，為快速診斷呼吸道病毒提供了切實(shí)有效的手段，并逐步取代分離培養(yǎng)，成為新一代的金標(biāo)準(zhǔn)。以核酸擴(kuò)增為主的分子診斷技術(shù)需在保持高敏感度和特異度的基礎(chǔ)上，向低成本、微型化、快速化方向發(fā)展，這樣不僅可在偏遠(yuǎn)地區(qū)和小型醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室中使用，還可應(yīng)用于床邊檢測領(lǐng)域，借助更快、更準(zhǔn)確的檢測技術(shù)，進(jìn)一步提高呼吸道感染預(yù)防、診斷、治療效率，使其致病率和致死率得到有效控制。

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