胡彥建，韓明子，胡彥華

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院1.消化內(nèi)科;2.普外科，黑龍江 哈爾濱 150086

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球常見惡性腫瘤之一，全球每年的肝癌新發(fā)病例數(shù)為74.8萬，死亡例數(shù)為69.6 萬[1-2]，在所有癌癥導(dǎo)致的死亡中肝癌居于第3位[3]。HCC癥狀不明顯，早期診斷率較低，5年生存率＜5%，確診時(shí)多數(shù)已發(fā)展為中晚期，發(fā)生遠(yuǎn)處擴(kuò)散轉(zhuǎn)移[4]。因此，研究HCC侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制，對改善肝癌患者預(yù)后、延長患者生存期，具有重要的意義。近來，已有相當(dāng)多的證據(jù)表明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[5]，其在肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著極其重要的作用。

1 EMT及其誘導(dǎo)調(diào)控因素簡述

1.1 EMT簡述 EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，在此過程中上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性、丟失細(xì)胞間緊密連接和黏附連接，獲得了浸潤性和游走遷移能力，變成了具有間質(zhì)細(xì)胞功能和特性的細(xì)胞。1982年Garry等初步證明上皮細(xì)胞會在特定的因素下暫時(shí)喪失其細(xì)胞極性，表現(xiàn)出具有移行能力的間質(zhì)細(xì)胞特性，提出了 EMT的概念[6]。EMT在胚胎發(fā)育時(shí)發(fā)生，參與了胚胎發(fā)育的各個(gè)階段，它在發(fā)育的初級階段參與了原腸胚、神經(jīng)嵴的形成，次級階段參與了胰腺、肝臟和生殖道的形成，第3階段參與心臟重構(gòu)。EMT除在胚胎發(fā)育中發(fā)揮作用，也參與組織損傷修復(fù)，例如上皮組織的傷口愈合過程中，增生的上皮細(xì)胞移行到傷口部位進(jìn)行修復(fù)的過程，也是一種EMT[7]。EMT是一種瞬時(shí)、可逆的過程，主要特征包括:(1)細(xì)胞黏附相關(guān)分子E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)降低，導(dǎo)致細(xì)胞黏附減弱，細(xì)胞分散;(2)細(xì)胞骨架重排，由角蛋白骨架變成波形蛋白骨架;(3)上皮細(xì)胞由原來排列緊密的圓形或方形細(xì)胞變?yōu)榕帕兴缮⒌乃笮渭?xì)胞形態(tài)[8];(4)纖維原細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞的特性的獲得，例如:波形蛋白(vimentin)、纖連蛋白(fibronectin)、Snail、Twist、Slug 及其它間質(zhì)標(biāo)記蛋白的表達(dá)上調(diào)。在既往研究中花了很長時(shí)間才意識到EMT是惡性腫瘤進(jìn)展的可能原因，主要是因?yàn)樵谀[瘤中EMT現(xiàn)象很難在時(shí)間和空間上得到追蹤。然而在體外實(shí)驗(yàn)中，許多腫瘤細(xì)胞株經(jīng)歷了部分或完全的EMT現(xiàn)象，而且癌細(xì)胞在發(fā)展過程中丟失了上皮細(xì)胞的特征，表現(xiàn)出細(xì)胞形態(tài)的多形性和惡性的潛能。近年來調(diào)控EMT的機(jī)制逐漸被闡明，許多在胚胎發(fā)育和腫瘤進(jìn)展中常見的信號途經(jīng)已經(jīng)得到證實(shí)。研究EMT的發(fā)生和調(diào)控機(jī)制，對于尋找治療惡性腫瘤特別是腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的目標(biāo)靶點(diǎn)具有重要意義。

1.2 EMT誘導(dǎo)調(diào)控因素 目前已知參與誘導(dǎo)及調(diào)控細(xì)胞發(fā)生EMT的因素很多。包括:(1)生長因子的誘導(dǎo)。細(xì)胞外信號可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，這些細(xì)胞外信號包括多種細(xì)胞因子和生長因子，以及缺血、缺氧等，其中生長因子在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT中的作用尤其受到關(guān)注，如轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor beta ，TGF-β)、肝細(xì)胞生長因子(hepatic growth factor，HGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等[9-10];(2)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄因子作為EMT調(diào)控過程中的下游因素，通過抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄水平，下調(diào)其表達(dá)，導(dǎo)致上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變。其中包括 Snail、Slug、Twist、ZEB1、Smad及核轉(zhuǎn)錄因子-kB(nuclear factor kappaB，NF-kB)[11-13]等轉(zhuǎn)錄因子。(3)信號通路的調(diào)控。新近研究通過構(gòu)建細(xì)胞系模型，發(fā)現(xiàn)許多信號通路可以調(diào)控EMT，如TGF-β信號途徑、磷脂酰肌醇3-激酶 (Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB又稱AKT)通路、Ras/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路、Wnt(wingless-type)/β-catenin通路、Notch信號通路及Hedgehog通路等[14-17];EMT的信號調(diào)控是個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，不但調(diào)控信號通路較多，而且不同的信號之間還存在著相互關(guān)聯(lián)。近來也有研究發(fā)現(xiàn)MicroRNA(miRNA)在EMT調(diào)控中也發(fā)揮重要作用[18-19]。以上因素與EMT有著密切的關(guān)系。此外，EMT發(fā)生還與細(xì)胞骨架、細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞間連接方式的改變相關(guān)。

2 EMT在原發(fā)性肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用

肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移涉及細(xì)胞黏附、運(yùn)動、增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的降解、機(jī)體免疫與腫瘤血管生成等環(huán)節(jié)，其分子機(jī)制主要有:與侵襲相關(guān)的抑癌基因的失活和癌基因的表達(dá)增加、與轉(zhuǎn)移有關(guān)的細(xì)胞因子及其受體表達(dá)水平的變化、基質(zhì)金屬蛋白酶異常表達(dá)、腫瘤微血管密度的影響等。人們在原發(fā)性肝癌的細(xì)胞及動物模型、臨床研究中發(fā)現(xiàn)了EMT現(xiàn)象，且EMT的發(fā)生與肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本文將詳述從不同途徑誘導(dǎo)及調(diào)控肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT對肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的作用。

2.1 微環(huán)境(低氧) 侍曉辰等[20]觀察低氧環(huán)境下2種具有不同侵襲、轉(zhuǎn)移能力的人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721和HepG2發(fā)生EMT情況和侵襲、轉(zhuǎn)移能力的改變。其結(jié)果顯示:低氧環(huán)境中，該2種肝癌細(xì)胞均由原來的緊密排列上皮樣狀態(tài)轉(zhuǎn)為較松散的紡錘體樣改變;Western blotting檢測顯示，2種肝癌細(xì)胞株的E-cadherin表達(dá)量明顯下降，而Vimentin表達(dá)量明顯升高;Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，2種肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力明顯增強(qiáng);SMMC-7721細(xì)胞的上述變化均較HepG2細(xì)胞明顯。上述說明低氧環(huán)境可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)肝癌細(xì)胞形態(tài)改變，引起細(xì)胞功能變化，并增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力，促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)的細(xì)胞發(fā)生的上述變化更明顯。

2.2 生長因子 王波等[21]應(yīng)用TGF-β1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7721，動態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，Western blotting和免疫熒光檢測EMT相關(guān)E-cadherin的表達(dá)，通過流式細(xì)胞儀分析TGF-β1誘導(dǎo)前后Side population(SP)細(xì)胞含量的變化。研究結(jié)果顯示:加入TGF-β1后，SMMC-7721細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變。免疫熒光提示定位于胞質(zhì)的表達(dá)陽性細(xì)胞明顯減少，Western blotting檢測提示其蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，說明TGF-β1能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞系發(fā)生EMT，從而在肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用。另外 TGF-β1誘導(dǎo) SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生EMT后，SP細(xì)胞比例分別從未誘導(dǎo)前的4.3%降低到誘導(dǎo)后的0.1%，分析其可能的機(jī)制，推測EMT狀態(tài)的誘導(dǎo)和維持在一定程度上抑制了腫瘤干細(xì)胞的增殖，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞向侵襲和轉(zhuǎn)移方向發(fā)展。王慶軍等[22]用 HGF處理肝細(xì)胞癌 SMMC-7721后，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)、Transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)、Western blotting技術(shù)研究HGF對肝癌細(xì)胞SMMC-7721上皮-間葉轉(zhuǎn)化的作用。并應(yīng)用PI3K抑制物L(fēng)Y29400210 μmol/L預(yù)處理細(xì)胞，觀察SMMC-7721的變化，研究PI3K對于HGF作用機(jī)制的影響。結(jié)果顯示:Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)顯示HGF處理的細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，蛋白印跡結(jié)果顯示HGF處理的細(xì)胞的道N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)和 Vimentin的表達(dá)增加，E-cadherin的表達(dá)減少。LY294002預(yù)處理后，細(xì)胞不再受HGF的影響，細(xì)胞的形態(tài)沒有明顯變化，Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果與未經(jīng)處理的SMMC-7721相同。蛋白印跡結(jié)果顯示:細(xì)胞的 N-cadherin、MMP-2、MMP-9、Vimentin和E-cadherin的表達(dá)變化不明顯。說明HGF能夠增強(qiáng)SMMC-7721的EMT能力，能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞SMMC-7721侵襲和轉(zhuǎn)移能力，降低細(xì)胞的黏附能力，其機(jī)制與PI3K有關(guān)。

2.3 轉(zhuǎn)錄因子 盧倩等[23]利用重組腺病毒載體pAdEasy-SNAIL高效感染HepG2肝癌細(xì)胞株，誘導(dǎo)外源性Snail1蛋白過表達(dá)，以空載腺病毒pAdEasy-GFP作為對照。利用RT-PCR、Western blotting和細(xì)胞免疫組織化學(xué)的方法，檢測轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞Snail1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平。隨機(jī)運(yùn)動實(shí)驗(yàn)及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染目的基因后運(yùn)動侵襲能力的改變。其結(jié)果顯示:(1)pAdEasy-SNAIL高效感染HepG2細(xì)胞，與對照組相比SNAILmRNA和Snail1蛋白表達(dá)均顯著增強(qiáng)，Snail1蛋白在胞漿和胞核著色明顯強(qiáng)化。(2)實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞，在mRNA和蛋白水平表達(dá) E-cadherin均顯著受到抑制，N-cadherin、Vimentin表達(dá)則明顯上調(diào)。(3)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)運(yùn)動實(shí)驗(yàn)中各觀察時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞空白區(qū)均小于對照組;侵襲實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)多于對照組。說明了外源性Snail1蛋白過表達(dá)能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞出現(xiàn)EMT樣變化，能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞運(yùn)動、侵襲能力。Yang 等[24]發(fā)現(xiàn)，與 Snail、Twist低表達(dá)的肝癌 Huh-7細(xì)胞相比，Snail、Twist高表達(dá)的肝癌Mahlavu細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。而在肝癌的動物模型中，過表達(dá)Snail/Twist，不僅可以促進(jìn)EMT的發(fā)生，還能提高肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力;相反，沉默Snail/Twist，肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力得到了抑制。上述結(jié)果說明了EMT可能通過其轉(zhuǎn)錄因子Snail/Twist促進(jìn)肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的發(fā)生。陳嬙等[25]通過收集97例肝細(xì)胞肝癌標(biāo)本及臨床病理資料，利用CD31標(biāo)記肝細(xì)胞肝癌微血管密度(microvessel density，MVD)，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測Twist1和MMP-9的表達(dá)，分析其表達(dá)與MVD及臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示:臨床分期Ⅲ～Ⅳ期的MVD高于Ⅰ～Ⅱ期，轉(zhuǎn)移組的MVD高于非轉(zhuǎn)移組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Twist1漿表達(dá)、Twist1核表達(dá)、MMP-9表達(dá)陽性患者的MVD高于陰性表達(dá)患者，Twist1漿表達(dá)、Twist1核表達(dá)、MMP-9表達(dá)陽性細(xì)胞率與MVD呈正相關(guān)。這說明肝細(xì)胞肝癌MVD的增高伴隨Twist1及MMP-9的高表達(dá)。表明腫瘤細(xì)胞表達(dá)Twist1預(yù)示著腫瘤局部MVD會增高，即發(fā)生EMT的肝細(xì)胞肝癌擁有更強(qiáng)的血管生成能力。而腫瘤細(xì)胞表達(dá)Twist1又可以增強(qiáng)MMP-9的活性，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)重塑，改善局部微循環(huán)，使得腫瘤生長和演進(jìn)。

2.4 信號通路 許秋然等[26]收集63例肝細(xì)胞癌組織及相對應(yīng)的癌旁組織應(yīng)用免疫組化，RT-PCR法檢測膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1(Gli1)在肝細(xì)胞癌及癌旁組織中的表達(dá)情況，同時(shí)應(yīng)用免疫組化法檢測Hedgehog信號通路配體sonic hedgehog(Shh)、EMT標(biāo)記物 Vimentin以及 E-cadherin癌旁組織中的表達(dá)情況，使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析肝細(xì)胞癌組織與癌旁正常組織Gli1的mRNA含量以及蛋白表達(dá)差異。使用卡方檢驗(yàn)分析Gli1蛋白在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系。使用 Spearmen秩檢驗(yàn)分析肝細(xì)胞癌組織中Gli1蛋白表達(dá)分別與Shh、Vimentin及 E-cadherin這3種蛋白表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果顯示，肝細(xì)胞癌組織中Gli1蛋白及mRNA含量明顯高于癌旁正常肝組織;Gli1蛋白表達(dá)分別與腫瘤肝內(nèi)轉(zhuǎn)移或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高Edmonson病理分級以及TNM腫瘤分期較晚有關(guān);肝細(xì)胞癌組織中Gli1蛋白表達(dá)與Shh、Vimentin蛋白表達(dá)呈明顯正相關(guān)，而與E-cadherin蛋白呈負(fù)相關(guān)。說明Gli1可能在Shh配體的作用下激活Hedgehog信號通路誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，并可能促進(jìn)肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的發(fā)生。Wang等[27]通過siRNA干擾等技術(shù)，證實(shí)Notch1-Snail1-E-cadherin途徑影響肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。最后，對臨床肝癌組織進(jìn)行了相關(guān)驗(yàn)證，證實(shí)Notch1高表達(dá)的患者中67% 的Snail1高表達(dá)，同時(shí)伴有E-cadherin的低表達(dá)，這一結(jié)果與肝癌細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)研究相符，即Snail1和E-cadherin與Notch1具有相關(guān)性。Lim等[28]報(bào)道Notch受體蛋白的活性形式即胞內(nèi)域(NICD)通過與鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail的結(jié)合能夠抑制其蛋白的表達(dá)，在一定情況下Notch信號通路與Snail功能存在拮抗。上述二者說明了EMT也可能通過Notch信號通路促進(jìn)肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的發(fā)生。綜上所述，EMT在肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用。

3 展望

原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率及致死率最高的惡性腫瘤之一，與其他惡性腫瘤一樣，肝癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是其治療失敗的主要原因。而目前對EMT在原發(fā)性肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用，已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，但其確切機(jī)制并不明確，仍需有待研究。

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