微小RNA?21在順鉑聯(lián)合5?氟尿嘧啶抑制肺癌細胞株作用中的表達變化

肖霞 李樹春 吳建中 馬蓉 曹海霞 馮繼鋒

微小RNA?21在順鉑聯(lián)合5?氟尿嘧啶抑制肺癌細胞株作用中的表達變化

肖霞 李樹春 吳建中 馬蓉 曹海霞 馮繼鋒

目的探討順鉑和5?氟尿嘧啶在體外聯(lián)合用藥對肺癌細胞株A549細胞存活率、細胞周期的影響以及在這過程中微小RNA?21（microRNA?21，miR?21）表達水平的變化。方法順鉑和5?氟尿嘧啶單藥或聯(lián)合用藥處理肺癌A549細胞后，采用CCK?8法檢測細胞存活率；倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化；流式細胞儀技術(shù)檢測細胞周期；實時熒光定量PCR檢測miR?21的表達變化。結(jié)果順鉑和5?氟尿嘧啶單藥對A549細胞的抑制作用都具有濃度依賴性，兩者聯(lián)合用藥48 h后細胞的存活率明顯低于單藥組（P＜0.05），并且細胞形態(tài)改變更加明顯，懸浮、變圓的細胞也更多；順鉑處理A549細胞后，將細胞阻滯于S期和G2期，5?氟尿嘧啶阻滯A549細胞于S期，聯(lián)合用藥后細胞阻滯于S期和G2期；隨著順鉑和5?氟尿嘧啶作用濃度的增加，miR?21的表達水平上調(diào)，聯(lián)合用藥后miR?21的表達亦上調(diào)，但趨勢沒有順鉑組明顯（P＜0.05）。結(jié)論順鉑在體外聯(lián)合5?氟尿嘧啶對A549細胞存活率的抑制有協(xié)同作用，同時可以上調(diào)細胞內(nèi)miR?21表達水平。

順鉑；5?氟尿嘧啶；微小RNA?21；非小細胞肺癌；A549細胞

全球范圍內(nèi)，肺癌是致死率最高的腫瘤之一，在所有男性因癌癥死亡病例者中肺癌占29%，在女性癌癥死亡病例者中肺癌占26%［1］，肺癌已成為腫瘤領(lǐng)域中研究最多的腫瘤之一。順鉑作為非小細胞肺癌化療方案中的一線藥物，其對腫瘤的細胞毒作用主要是通過形成鉑?DNA復(fù)合物，但其耐藥性制約了其療效［2?3］。5?氟尿嘧啶主要通過阻斷脫氧嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶核苷酸而干擾DNA的合成。然而順鉑聯(lián)合5?氟尿嘧啶處理人肺腺癌細胞株A549細胞的研究報道還不是很多，尤其是機制研究更是很少。最近有文獻報道微小RNA?21（microRNA?21，miR?21）介導(dǎo)參與了非小細胞肺癌順鉑耐藥過程［4］。至于miR?21在順鉑聯(lián)合5?氟尿嘧啶對A549細胞處理過程中的表達水平尚不清楚。本研究主要探討順鉑在體外聯(lián)合5?氟尿嘧啶對A549細胞的存活率、細胞周期分布及miR?21表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 CO2培養(yǎng)箱（Thermo，US），RPMI?1640不完全培養(yǎng)基（凱基生物），胎牛血清（Hy?clone），0.25%胰蛋白酶（GIBCO，USA），DMSO（Bio?sharp，USA），生物安全柜（BIOBASE），生理鹽水（南京小營藥業(yè)集團有限公司），順鉑（Sigma，USA），5?氟尿嘧啶（Sigma，USA），CCK?8（日本Dojindo Laboratorise），酶標(biāo)自動分析儀（Bio?Tech，US），試劑盒miRACLE isolation kit for cells／tissues（Jinfiniti Biosci?ences，US），OD?1000＋Spectrophotometer（One Drop），TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（ABI，US），TaqMan MicroRNA Assays（ABI，US），Thermocycler（Biometra，Germany），ABI PRISM 7900 systerm（Applied Biosystems），流式細胞儀（Becton?Dickinson，San Jose，CA，USA）。

1.2 細胞系及細胞培養(yǎng) 人肺腺癌細胞株A549訂購于中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所。細胞接種在含10%胎牛血清、80 U／ml青霉素和0.08mg／ml鏈霉素的RPMI?1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2、85%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞呈貼壁生長，3 d后按1∶4傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 CCK?8細胞活力檢測 取對數(shù)生長期的A549細胞消化，制備單細胞懸液，以濃度為6×103個／孔接種于96孔板中（100μl／孔），置于37℃、5%CO2、85%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。貼壁后經(jīng)不同濃度順鉑及5?氟尿嘧啶處理（每個藥物濃度設(shè)3個復(fù)孔，終體積為200μl／孔）并分別培養(yǎng)24、48 h后，去除培養(yǎng)液，每孔加入10μl CCK?8試劑和90μl RPMI?1640不完全培養(yǎng)基（終體積為100μl／孔），孵育50 min后用酶標(biāo)儀（波長為450 nm）測定每孔A值，按下列公式計算細胞存活率：存活率＝［（實驗組平均A值?空白對照組A值）／（實驗對照組平均A值?空白對照組A值）］×100%。實驗重復(fù)3次。

1.4 細胞形態(tài)觀察 對數(shù)生長期的A549細胞消化，制備單細胞懸液，接種于6孔板中（2 ml／孔），置于37℃、5%CO2、85%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。貼壁后經(jīng)不同濃度順鉑及5?氟尿嘧啶處理（終體積為3 m l／孔）并培養(yǎng)48 h后用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。

1.5 細胞周期檢測 取對數(shù)生長期A549細胞消化，制備單細胞懸液，接種于6孔板（2ml／孔），置于37℃、5% CO2、85%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。貼壁后經(jīng)不同濃度順鉑及5?氟尿嘧啶處理（終體積為3ml／孔）并培養(yǎng)48 h后收集貼壁細胞和上清液中的死細胞，用PBS洗滌2次后用250μl RPMI?1640不完全培養(yǎng)基重懸，并加入750μl 75%酒精固定，于－20℃冰箱保存過夜后用PBS洗滌離心并重懸，加入50μg／μl PI染色并于室溫避光孵育30min后過300目篩網(wǎng)，置流式管中用流式細胞儀檢測細胞周期，實驗重復(fù)3次。

1.6 miR?21的表達檢測 取對數(shù)生長期的A549細胞消化，制備單細胞懸液，接種于6孔板中（2 ml／孔），置于37℃、5%CO2、85%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。貼壁后經(jīng)不同濃度順鉑及5?氟尿嘧啶處理（終體積為3 ml／孔），培養(yǎng)48 h后收集貼壁細胞。以試劑盒miRACLE isolation kit for cells／tissues提取細胞中的RNA，OD?1000＋Spectrophotometer測定RNA濃度并通過A260／280及A260／230的吸收比值判斷RNA的純度。將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以cDNA作為模板進行實時定量PCR擴增（U6 snRNA為內(nèi)參）。數(shù)據(jù)采用2?ΔΔCt法進行分析，重復(fù)實驗3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 12.0進行分析。實驗結(jié)果均用±s表示，均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 順鉑和5?氟尿嘧啶單藥及聯(lián)合用藥對A549細胞的抑制作用 CCK?8結(jié)果顯示，以不同濃度的順鉑、5?氟尿嘧啶分別處理A549細胞24、48 h后，兩單藥皆可誘導(dǎo)抑制A549細胞活力，進而降低細胞存活率，證明順鉑和5?氟尿嘧啶都對A549細胞存在抑制作用，且對A549細胞的抑制作用具有時間、濃度依賴性（圖1A、B）。以4、6μg／ml的順鉑處理A549細胞48 h后，細胞存活率分別為（55.06±6.06）%和（15.10± 4.10）%；以4μg／ml的5?氟尿嘧啶處理A549細胞48 h后，細胞存活率為（57.17±2.17）%；以4、6μg／ml的順鉑和4μg／ml的5?氟尿嘧啶聯(lián)合處理A549細胞48 h后，細胞存活率分別為（15.53±3.53）%和（4.15± 3.15）%。聯(lián)合用藥組與單藥組相比，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1C。

圖1 不同濃度的順鉑、5?氟尿嘧啶單藥24 h或48 h及聯(lián)合用藥處理A549細胞48 h后的細胞存活率

2.2 聯(lián)合用藥對A549細胞形態(tài)改變的影響 以4 μg／ml的順鉑處理A549細胞48 h后，倒置顯微鏡觀察到細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，4μg／ml的5?氟尿嘧啶處理A549細胞48 h后，倒置顯微鏡亦觀察到細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，聯(lián)合用藥后細胞形態(tài)比單藥變化更明顯，且貼壁細胞數(shù)與CCK?8所得存活率結(jié)果相似。見圖2（封二）。

2.3 聯(lián)合用藥對A549細胞周期的影響 以4μg／ml的順鉑處理A549細胞48 h后，G1期細胞減少，S期和G2期細胞增加；4μg／ml的5?氟尿嘧啶處理A549細胞48 h后，G1期和G2期細胞減少，S期細胞增加；兩藥聯(lián)合處理細胞48 h后G1期細胞減少，S期和G2期細胞增加（表1）。各實驗組間細胞周期分布的比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同實驗組處理48 h后A549細胞周期的改變（±s）

表1 不同實驗組處理48 h后A549細胞周期的改變（±s）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與順鉑組比較，△P＜0.05

組別細胞周期（%）G0／G1 S G2／M對照組71.04±0.90 21.39±0.98 7.57±0.20順鉑組15.42±4.68?27.53±2.43?57.05±0.61?5?氟尿嘧啶組54.35±2.85?40.36±3.24?5.29±0.29?聯(lián)合組50.82±3.38△39.91±2.09△9.27±0.63△

2.4 順鉑和5?氟尿嘧啶單藥及聯(lián)合用藥后A549細胞中miR?21的表達變化 qRT?PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)在以終濃度為1、2、4、6μg／ml的順鉑誘導(dǎo)的A549細胞活力降低過程中，miR?21的表達有差異（圖3）。在順鉑誘發(fā)的A549凋亡（或死亡）中，miR?21的表達增加，而且在相同暴露時間內(nèi)，隨著順鉑作用濃度的增加，miR?21的表達逐漸增加（圖3A）。在5?氟尿嘧啶誘發(fā)的A549凋亡（或死亡）過程中，miR?21的表達增加，且在5?氟尿嘧啶暴露48 h后，隨著5?氟尿嘧啶作用濃度的增加，miR?21的表達增加趨勢更加明顯（圖3B）。

以終濃度為4、6μg／ml的順鉑處理A549細胞48 h后，miR?21的表達分別上調(diào)（4.29±0.2）倍、（5.36± 0.12）倍；以4μg／ml的5?氟尿嘧啶處理A549細胞48 h后，miR?21的表達上調(diào)（4.37±0.2）倍；聯(lián)合用藥48 h后miR?21的表達分別上調(diào)（3.72±0.18）倍、（4.75± 0.2）倍，上調(diào)倍數(shù)低于順鉑組。聯(lián)合用藥組與順鉑組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3C）。

3 討論

2012年的癌癥數(shù)據(jù)表明自1999年起癌癥死亡率逐年下降超過1%，其中肺癌占據(jù)男性總下調(diào)比的40%左右［1］，肺癌的治療效果對整個癌癥領(lǐng)域病死率的降低都有很大的影響。順鉑作為NCCN指南中非小細胞肺癌的一線治療藥物之一，其效果有目共睹，但是隨著晚期癌癥治療的開展，其獲得性耐藥的問題日益顯著，以致于其治療效果受到限制，成為臨床治療中的瓶頸［2］。順鉑屬于細胞周期非特異性藥物，主要通過與DNA單鏈內(nèi)兩點或雙鏈發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)，從而抑制細胞的DNA復(fù)制過程，使之發(fā)生細胞凋亡［5］。5?氟尿嘧啶屬于不典型的細胞周期特異性藥物，其主要是在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為有效的氟尿嘧啶脫氧核苷酸后，通過抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶來阻斷脫氧嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)換成胸腺嘧啶核苷酸，從而干擾DNA的合成。已有文獻報道順鉑聯(lián)合5?氟尿嘧啶對腫瘤細胞的抑制具有協(xié)同作用，本研究以肺癌細胞株A549為模型同樣證實了這一觀點，然而其中的機制尚不清楚。

圖3 不同濃度的順鉑、5?氟尿嘧啶單藥及聯(lián)合用藥處理A549細胞48 h后miR?21的表達變化

微小RNA（miRNAs）是一類長度為20～25個核苷酸組成的非編碼單鏈小分子RNA。miR?21是microRNA家族中的一個亞型，位于17q23.2染色體FRA17B脆性區(qū)域上，是具有自主轉(zhuǎn)錄單位的miRNA，并且有高度保守性。目前認為miR?21在許多人類癌細胞中都表現(xiàn)為過表達，通過作用于多種靶基因，參與細胞增殖、分化、凋亡，同時與腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等密切相關(guān)［6?9］。Gao等［4］通過miRNA芯片技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)miR?21在A549／DDP細胞株中的表達比A549細胞高，并且已經(jīng)證明miR?21過表達可導(dǎo)致細胞對順鉑的敏感性降低。Rossi等［10］發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細胞在5?氟尿嘧啶的持續(xù)暴露下miR?21的表達有上調(diào)趨勢。同時Valeri等［11］研究證明miR?21的過表達降低了細胞對5?氟尿嘧啶的敏感性。本實驗研究發(fā)現(xiàn)在順鉑處理后細胞內(nèi)的miR?21表達上調(diào)，在5?氟尿嘧啶處理A549細胞后miR?21也表達增加，順鉑聯(lián)合5?氟尿嘧啶處理后細胞內(nèi)的miR?21的表達亦有所增加，但上調(diào)趨勢明顯低于順鉑單藥組，這說明miR?21的表達可能與聯(lián)合用藥的機制有某種聯(lián)系，雙藥處理后，細胞內(nèi)對藥物敏感性的調(diào)控機制被啟動，對藥物的耐藥趨勢發(fā)生了改變，以致miR?21的表達上調(diào)，但其中的機制有待進一步研究。

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Differential expression ofm iR?21 in the suppression of A549 cells w ith cisp latin and 5?fluorouracil

XIAO Xia，WU Jian?zhong，MA Rong，CAO Hai?xia，F(xiàn)ENG Ji?feng．Nanjing Medical University Affiliated Cancer Hospital，Nanjing 210009，China；LIShu?chun．Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China

ObjectiveTo investigate the effect of cisplatin in combination with 5?fluorouracil in vitro on the viabili?ty，cell cycle andmiR?21 expression level of A549 cells.M ethodsThe inhibitory effectof cisplatin，5?fluorouracil，cis?platin in combination with 5?fluorouracil on the viability of A549 cells were tested by CCK?8 assay in vitro.The change of cellmorphology was observed with inverted microscope，while cell cycle was assayed by flow cytometry.The expression of miR?21 wasmeasured by real?time quantitative PCR.ResultsThe growth of A549 cells was inhibited by cisplatin in a dose?dependentmanner，as well as 5?fluorouracil.The suppression ratio of the combined group treated with cisplatin com?bined with 5?fluorouracilwas higher than that of the single drug group（P＜0.05）；The change of cellmorphology of combi?nation group wasmore apparent than that of themonotherapy group，and more suspension and round cells were observed. Cisplatin arrested A549 cell cycle at Sand G2phase.In 5?fluorouracil group，cellswere arrested at Sphase.In combination group，G1phase cells decreased while S／G2phase cells increased.With the increase of the concentration of cisplatin and 5?fluorouracil，the expression level ofmiR?21 was increased.The expression levelofmiR?21 in the combination group was al?so increased，but the trend was notobvious as that inmonotherapy group（P＜0.05）.ConclusionsThe viability of A549 cells could be inhibited and the expression level ofmiR?21mightbe increased by cisplatin in combination with 5?fluoroura?cil in vitro.

cisplatin；5?fluorouracil；microRNA?21；non?small cell lung cancer；A549 cells

R 734.2

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2014.02.009

2013?11?09）

210009江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，江蘇省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（肖霞，吳建中，馬蓉，曹海霞，馮繼鋒）；210009江蘇省南京市，南京工業(yè)大學(xué)（李樹春）

馮繼鋒，Email：fengjifengx＠sina.cn