江 軍，李軍星，康 磊，3，袁秀芳，徐麗華，王一成

副豬嗜血桿菌四環(huán)素耐藥基因TetB的PCR檢測方法建立

江 軍1，2，李軍星1，康 磊1，3，袁秀芳1，徐麗華1，王一成1

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230061）

在本實驗室前期研究的基礎(chǔ)上，選取與四環(huán)素耐藥表型相關(guān)性較好的TetB基因，建立PCR方法，以探索副豬嗜血桿菌耐藥性的快速檢測方法。本研究利用四環(huán)素主要耐藥基因TetB的引物，對PCR反應(yīng)條件進行優(yōu)化，以副豬嗜血桿菌基因組DNA為模板，未出現(xiàn)非特異性擴增條帶，PCR擴增條帶單一。將TetB基因克隆至pMD 19T載體，以重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，確定了最低檢測拷貝數(shù)，經(jīng)測定，最低檢測拷貝數(shù)為1.54×103。以不同稀釋度的21A7菌株基因組DNA為模板，確定了最低細(xì)菌檢出量，經(jīng)測定，最低檢測細(xì)菌數(shù)量為4.6×103個。該方法為建立臨床快速檢測副豬嗜血桿菌耐藥性奠定了基礎(chǔ)。

副豬嗜血桿菌；耐藥基因TetB；PCR檢測

副豬嗜血桿菌（Haemophi1us parasuis，Hps）是豬格拉澤氏?。℅1asser′s disease）的病原菌，引起豬多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等［1］。近年來，豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病等免疫抑制性疾病常繼發(fā)Hps感染而增加發(fā)病率和死亡率，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的損失［2］，是目前影響浙江省養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的細(xì)菌之一［3］。

細(xì)菌對四環(huán)素產(chǎn)生耐藥的機制有3種。一是核糖體保護機制，編碼核糖體保護蛋白與核糖體結(jié)合，阻止四環(huán)素與核糖體的結(jié)合，保證細(xì)菌蛋白質(zhì)順利合成，耐藥基因有TetM，TetO，TetS，TetW，TetQ，TetT等［4］；二是藥物排出泵機制，此機制是將進入細(xì)胞內(nèi)的四環(huán)素由導(dǎo)出泵排出細(xì)胞外，四環(huán)素類藥物排出泵機制相關(guān)的耐藥基因包括TetA，TetB，TetC，TetD，TetE，TetG，TetH，TetI，TetJ，TetZ，Tet30，Tet31，TetK，TetL，OtrB，Tcr3，TetPA，TetV和TetY等［5］；三是酶鈍化機制，TetX基因是唯一通過產(chǎn)生滅活四環(huán)素的酶而使細(xì)菌耐藥的［6］。一般認(rèn)為，革蘭氏陰性基因細(xì)菌的耐藥機制以抗生素的導(dǎo)出泵機制為主，對豬體內(nèi)細(xì)菌及腸道細(xì)菌而言，其決定導(dǎo)出泵的耐藥性基因以TetB為主［7］。

本研究在前期浙江省副豬嗜血桿菌耐藥性調(diào)查中，確定了TetB為引起副豬嗜血桿菌四環(huán)素耐藥表型的最主要基因的基礎(chǔ)上，以TetB為檢測對象，通過條件優(yōu)化，初步建立了副豬嗜血桿菌四環(huán)素耐藥表型的快速檢測方法，為臨床上防治副豬嗜血桿菌病合理使用抗菌藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

副豬嗜血桿菌菌株由本實驗室從浙江省臨床發(fā)病豬中分離保存，其中21A7菌株經(jīng)本實驗室檢測，具備四環(huán)素耐藥性及TetB耐藥基因。PCR試劑及pMD 19T載體為TakaRa寶生物工程 （大連）有限公司產(chǎn)品，蛋白酶K購自生工生物工程 （上海）股份有限公司，細(xì)菌培養(yǎng)基購自O(shè)XOID LTD，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 菌株基因組DNA的提取

以蛋白酶K消化法［8］提取DNA。取400μL純培養(yǎng)的副豬嗜血桿菌菌液于1.5 m L離心管中，12 000 r·min-1離心3 m in；棄上清，加入400μL TE（pH值8.0）重懸菌體，12 000 r·min-1離心3 min；棄上清，加入400μL Tris（0.000 5%Tween-20，0.1mo1·L-1Tris，pH值8.5）重懸菌體，再加入6μL蛋白酶K（20 mg·m L-1），56℃作用45 m in，100℃再作用20 min，12 000 r·m in-1離心1 min。取上清作為模板進行PCR擴增。

1.3 PCR反應(yīng)

［3］中的TetB引物，TetB1引物序列為5′-TGGTTAGGGGCAAGTTTTGG-3′，640 bp；TetB2引物序列為5′-GAGCATTGGTAAGGCTC-3′，640 bp。

PCR體系為25μL，包括1×PCR Buffer（含1.5 mM MgC12）、200μmo1·L-1dNTP混合物、各10 pmo1·L-1的上游引物及下游引物、0.2 U的r Taq聚合酶和2μL的模板DNA。

PCR運行程序為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性20 s，56℃退火20 s，72℃延伸30 s，進行32個循環(huán)；最后再72℃延伸5 m in。取5μL的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

1.4 重組質(zhì)粒pM D19T-TetB的構(gòu)建

連接。取TetB的PCR產(chǎn)物與pMD 19T Vector連接。連接體系為10μL，包括TetB的PCR產(chǎn)物4.5μL，pMD 19T Vector 0.5μL，So1utionⅠ5μL。將混合物置于16℃金屬浴中連接3 h。

轉(zhuǎn)化。將10μL的連接產(chǎn)物加入到100μL的大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰上放置30 min，42℃熱激45 s，冰上再放置1 min后加入700μL無抗性的LB液體培養(yǎng)基，放于37℃，200 r·min-1的搖床中1 h。然后取100μL菌液均勻涂布于含氨芐 （50μg·m L-1）抗性的LB平板上，37℃溫箱中過夜培養(yǎng)。

挑菌鑒定。從長菌的平板上隨意挑取5個單菌落分別至2 m L含氨芐（50μg·m L-1）抗性的LB液體培養(yǎng)基中，放于37℃，200 r·min-1的搖床中搖2 h。分別取2μL菌液作模板，進行PCR擴增。取5μL的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。取1 m L呈陽性的菌液送去華大公司測序。

提取重組質(zhì)粒。取150μL陽性菌液于15 m L含氨芐 （50μg·m L-1）抗性的LB液體培養(yǎng)基中，放于37℃，200 r·min-1的搖床中過夜。取菌液按質(zhì)粒提取試劑盒說明提取重組質(zhì)粒pMD 19T-TetB。將提取的重組質(zhì)?；靹蚝蠓盅b到1.5 m L的離心管中，用核酸蛋白分析儀測定重組質(zhì)粒的濃度及純度（D260/D280），用作TetB基因的標(biāo)準(zhǔn)模板，存放于-20℃冰箱。

1.5 特異性試驗

選取不含四環(huán)素耐藥性的10個臨床菌株，進行純培養(yǎng)，以蛋白酶K消化法提取純培養(yǎng)細(xì)菌的基因組DNA，以總基因組為模板，進行TetB基因擴增，同時設(shè)以水為模板的陰性對照，以及以pMD 19T-TetB為模板的陽性對照。

1.6 敏感性試驗

1.6.1 對TetB基因的標(biāo)準(zhǔn)模板檢測敏感度

將上述所提的標(biāo)準(zhǔn)模板重組質(zhì)粒pMD19T-TetB作10倍逐級稀釋，稀釋度為102～109。每個稀釋度分別取1μL作模板，進行PCR擴增。取5μL的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳。

1.6.2 對TetB基因的標(biāo)準(zhǔn)模板檢測敏感度

復(fù)蘇21A7菌株于無抗性的TSA平板上培養(yǎng)過夜，取單菌落于2 m L無抗性的LB液體培養(yǎng)基中純培養(yǎng)3～4 h使其處于對數(shù)生長期。取100μL對數(shù)生長期菌液于1.5 m L離心管，用無抗性的LB液體培養(yǎng)基對菌液作10倍逐級稀釋，稀釋度為106～109。取各個稀釋度的菌液100μL涂于無抗性的TSA平板上，37℃溫箱過夜培養(yǎng)。根椐菌落數(shù)計算對數(shù)生長期純培養(yǎng)菌液的細(xì)菌濃度。

取500μL對數(shù)生長期的純培養(yǎng)菌液于1.5 m L離心管，以蛋白酶K消化法提取純培養(yǎng)的21A7細(xì)菌的基因組DNA。將DNA作10倍逐級稀釋，稀釋度為100～106。每個稀釋度分別取2μL作模板，進行PCR擴增。取5μL的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 TetB基因PCR擴增

以副豬嗜血桿菌基因組DNA為模板，擴增到約640 bp的基因片段，與預(yù)期大小相符 （圖1）。

圖1 TetB基因PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒pM D 19T-TetB的PCR鑒定

以菌液為模板進行TetB基因擴增，PCR結(jié)果顯示，隨機挑取的5個菌落都為陽性克隆 （圖2），測序結(jié)果證實為TetB基因。

圖2 pMD 19T-TetB的PCR鑒定結(jié)果

2.3 特異性試驗結(jié)果

對10個不同臨床分離株進行PCR擴增，電泳結(jié)果顯示，TetB的引物具有良好的特異性，與受試臨床分離株的基因組無非特異性擴增 （見圖3）。

圖3 特異性試驗PCR結(jié)果

2.4 敏感度

經(jīng)測定，pMD 19T-TetB重組質(zhì)粒的濃度為0.056μg·μL-1，D260/D280=1.843，符合實驗要求。該PCR方法的最低可以檢測到107稀釋的1 μL質(zhì)粒 （圖4）。TetB基因的拷貝數(shù)=（6.02× 1023拷貝數(shù)·mo1-1）×（質(zhì)粒濃度g·m L-1）/（核苷酸分子量g·mo1-1）=（6.02×1023拷貝數(shù)·mo1-1）×（5.6×10-5g·m L-1）/（2 195 160 g·mo1-1），未經(jīng)稀釋的質(zhì)粒為1.54×1013拷貝數(shù)·mo1-1。因此，重組質(zhì)粒經(jīng)107稀釋后1μL所含的拷貝數(shù)為1.54×103，即該PCR能檢測到的最低質(zhì)粒含量為1.54×103個。

21A7菌株純培養(yǎng)菌液稀釋后，涂TSA平板后的長菌情況為106稀釋度的平板上長菌最多，約為230個單菌落，所以可知1 m L菌液中細(xì)菌的數(shù)目為230×106×（1 m L/100μL）=2.3×109個· mL-1。21A7菌株DNA各個稀釋度的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖5，該PCR方法可以檢測到103稀釋的2μL基因組DNA，即可以檢測到4.6×103個的細(xì)菌總DNA。

圖4 以重組質(zhì)粒為模板的敏感性試驗結(jié)果

圖5 以副豬嗜血桿菌總DNA為模板的敏感性試驗結(jié)果

3 小結(jié)和討論

四環(huán)素具有抗菌譜廣、價格低廉等特點，因此是獸醫(yī)臨床最常用的抗生素之一。隨著四環(huán)素的大量使用，結(jié)伴而來的就是細(xì)菌耐藥性的激增，檢測四環(huán)素耐藥基因是判斷細(xì)菌四環(huán)素耐藥性的重要的快速手段。細(xì)菌四環(huán)素的耐藥基因有數(shù)十種之多，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)劉維紅等［9］對33株豬源沙門氏菌進行了TetA，TetB，TetC，TetD，TetE，TetG，TetK等四環(huán)素耐藥基因檢測，發(fā)現(xiàn)其中29株攜帶TetB基因，與四環(huán)素耐藥表型的符合率為87.9%，但并未在其他4個耐藥菌株中檢測到上述7種耐藥基因。這與本實驗室前期實驗發(fā)現(xiàn)的副豬嗜血桿菌TetB基因與四環(huán)素耐藥表型的符合率（80.56%）［3］較為接近。2010年張純萍等［10］從269株豬雞大腸桿菌中檢出TetA，TetB和TetM的比率為87.9%，28.4%和15.5%。因此，不同宿主來源或不同菌株中四環(huán)素耐藥基因的種類差異較大。

建立細(xì)菌耐藥性的快速診斷技術(shù)，對細(xì)菌性傳染病的治療具有重要的意義。目前臨床上細(xì)菌耐藥性檢測大多采用藥敏片試驗方法，需要較長檢測時間，難以快速診斷。本研究在綜合分析本實驗室前期有關(guān)副豬嗜血桿菌耐藥表型和耐藥基因相關(guān)性的基礎(chǔ)上，選取相關(guān)性較高的四環(huán)素耐藥基因為檢測對象，探索建立副豬嗜血桿菌四環(huán)素抗性的PCR快速診斷方法。所建立的PCR檢測方法與副豬嗜血桿菌基因組無非特異性擴增，最低可以檢測4.6 ×103個的細(xì)菌總DNA，可用于快速判斷實驗室培養(yǎng)的副豬嗜血桿菌耐藥性，克服了細(xì)菌培養(yǎng)檢測藥物敏感性需要較長時間的弊端，對于促進臨床合理應(yīng)用抗生素將具有重要意義。但該方法不建議用于臨床病料樣品的直接檢測，因為病料中可能污染攜帶TetB基因的其他種類細(xì)菌而導(dǎo)致假陽性。

如前所述，細(xì)菌四環(huán)素耐藥基因種類多，包括TetA，TetB，TetC，TetD，TetE，TetG，TetH，TetI等，其中多個基因與副豬嗜血桿菌四環(huán)素耐藥表型的對應(yīng)關(guān)系尚不明確，如進一步闡明副豬嗜血桿菌四環(huán)素耐藥性與各種耐藥基因的相關(guān)性，建立基于多種耐藥基因的多重PCR檢測方法，將進一步提升副豬嗜血桿菌四環(huán)素耐藥表型的快速檢測實用水平。

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（責(zé)任編輯：盧福莊）

S 854

B

0528-9017（2014）12-0000-00

文獻(xiàn)著錄格式：江軍，李軍星，康磊，等.副豬嗜血桿菌四環(huán)素耐藥基因TetB的PCR檢測方法建立 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（12）：00 -00.

2014-09-17

畜禽健康養(yǎng)殖科技創(chuàng)新團隊項目 （2010R50027）

江 軍 （1989-），女，河北保定人，碩士，Te1：15058127581，Emai1：1146050993@qq.com

王一成 （1957-），男，浙江溫嶺人，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事豬病防控研究。E-mai1：95711@sina.com