人工合成的納豆激酶基因轉(zhuǎn)化煙草的研究

劉靚蕾 張妍 孫曉蕾 韓嵐 滿達(dá)呼斯琴 哈斯阿古拉

（內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 內(nèi)蒙古自治區(qū)牧草與特色作物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010021）

人工合成的納豆激酶基因轉(zhuǎn)化煙草的研究

劉靚蕾 張妍 孫曉蕾 韓嵐 滿達(dá)呼斯琴 哈斯阿古拉

（內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 內(nèi)蒙古自治區(qū)牧草與特色作物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010021）

根據(jù)植物偏愛密碼子人工合成的納豆激酶基因sNK和其中插入番茄果實(shí)特異表達(dá)基因E8第一內(nèi)含子的納豆激酶基因sNK-E8i，通過農(nóng)桿菌侵染的方法轉(zhuǎn)化到煙草NC89中。經(jīng)PCR檢測，得到12株轉(zhuǎn)sNK基因煙草植株和10株轉(zhuǎn)sNK-E8i基因煙草植株，初步證明目的基因已整合到煙草基因組中；RT-PCR檢測有9株轉(zhuǎn)sNK基因煙草植株和10株轉(zhuǎn)sNK-E8i基因煙草植株為陽性；通過RT-qPCR將兩種基因在煙草中的表達(dá)量進(jìn)行比較，結(jié)果表明轉(zhuǎn)sNK-E8i基因的植株中納豆激酶的表達(dá)量比轉(zhuǎn)sNK基因的植株中高；通過纖維蛋白平板法檢測其活性，共有5株轉(zhuǎn)sNK基因煙草植株和3株轉(zhuǎn)sNK-E8i基因煙草植株檢測到溶圈，說明目的基因在部分轉(zhuǎn)基因煙草中可正常轉(zhuǎn)錄和翻譯并表現(xiàn)出溶栓活性。經(jīng)加代培養(yǎng)已得到T1代轉(zhuǎn)基因植株。

納豆激酶 人工合成 植物偏愛密碼子 煙草 纖維蛋白平板法

納豆激酶（nattokinase，NK）是Sumi等［1］于1987年首先在日本傳統(tǒng)發(fā)酵食品納豆中發(fā)現(xiàn)并命名。該酶是由納豆枯草桿菌（Bacillus subtilis var. natto）產(chǎn)生的一種堿性絲氨酸蛋白酶，具有非常高的溶栓活性。1992年，Nadamura等［2］首次克隆了納豆激酶基因并測定了全基因序列，使得利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)納豆激酶成為可能。2004年，張淑梅等［3］使納豆激酶基因在E. coli DH5α中實(shí)現(xiàn)了分泌型表達(dá)，表達(dá)的目的蛋白占菌體總蛋白的21.5%，經(jīng)分離純化得到的納豆激酶蛋白干粉活性高達(dá)2 000 U/mg。2007年，黃磊等［4］在蛋白缺陷型枯草芽孢桿菌中表達(dá)了納豆激酶原基因和只編碼納豆激酶成

熟肽的納豆激酶基因，兩者的表達(dá)產(chǎn)物均具有溶栓活性。2010年，蔡立濤等［5］實(shí)現(xiàn)納豆激酶在巴斯德畢赤酵母中的分泌表達(dá)，并以純化產(chǎn)物為抗原制備兔抗納豆激酶血清，經(jīng)檢測表達(dá)產(chǎn)物具有較好的溶栓活性和免疫原性。

由于當(dāng)前的納豆激酶表達(dá)系統(tǒng)多以微生物表達(dá)系統(tǒng)為主，因此納豆激酶的生產(chǎn)一般使用的是通過液體發(fā)酵罐分離提取納豆激酶菌株的方法。但是此種生產(chǎn)方式在下游加工工藝方面，如工程菌的發(fā)酵、表達(dá)產(chǎn)物的分離純化等仍需較高成本。而植物生物反應(yīng)器同其相比，具有品質(zhì)高、安全性好等優(yōu)勢，且其成本僅為微生物培養(yǎng)的2%-10%。因此，有部分學(xué)者開始將方向轉(zhuǎn)向了以植物生物反應(yīng)器為載體生產(chǎn)納豆激酶的研究。2005年，張鋒等［6］構(gòu)建獲得了納豆激酶基因植物表達(dá)載體并將其整合到番茄基因組中，但沒有對轉(zhuǎn)基因植株中納豆激酶的活性和含量進(jìn)行測定。2009年，張靜等［7］將編碼納豆激酶基因成熟肽序列轉(zhuǎn)化到煙草及番茄中，得到的轉(zhuǎn)基因植株中納豆激酶基因可正常表達(dá)并具有溶栓活性。

但是，以植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白經(jīng)常出現(xiàn)外源基因表達(dá)量低的問題，因此針對這一問題，本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)植物偏愛密碼子［8-10］人工設(shè)計(jì)合成納豆激酶基因（GenBank登錄號：KJ495732），并在其ORF第519和第520個堿基之間插入番茄果實(shí)特異表達(dá)基因E8的第一內(nèi)含子（GenBank登錄號：X13437.1），分別構(gòu)建了植物雙元表達(dá)載體pPZP221（35s-sNK-nos）和pPZP221（35s-sNK-E8i-nos），通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，分別將人工合成的納豆激酶基因sNK和插入番茄果實(shí)特異表達(dá)基因E8第一內(nèi)含子的納豆激酶基因sNK-E8i轉(zhuǎn)化到模式植物煙草中，并對轉(zhuǎn)基因植株中納豆激酶基因表達(dá)及酶活性進(jìn)行測定，以期提高納豆激酶在煙葉中的表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 煙草（Nicotiana tabacum L.）品種NC89原種，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所賈興華研究員提供。

1.1.2 菌種和質(zhì)粒 pPZP221（35s-nos）質(zhì)粒、農(nóng)桿菌LBA4404均為本實(shí)驗(yàn)室保存。以植物偏愛密碼子進(jìn)行序列優(yōu)化的納豆激酶全長基因sNK、在sNK中間插入番茄果實(shí)特異表達(dá)基因E8的第一內(nèi)含子的納豆激酶基因sNK-E8i及其植物表達(dá)載體pPZP221（35s-sNK-nos）、pPZP221（35s-sNK-E8i-nos）由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.3 培養(yǎng)基 萌發(fā)培養(yǎng)基：MS+0.7% 瓊脂粉；芽誘導(dǎo)（共）培養(yǎng)基（YN）：MS+0.1 mg/L IAA+1 mg/L 6-BA+0.7% 瓊脂粉；選擇培養(yǎng)基（YN++）：MS+0.2 mg/L IAA+2 mg/L 6-BA+40 mg/L慶 大 霉 素（Gen）+200 mg/L頭孢霉素（Cef）+0.7% 瓊脂粉；生根培養(yǎng) 基（GN++）：MS+0.5 mg/L IAA+40 mg/L Gen+100 mg/L Cef+0.7% 瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的培養(yǎng) 用70%的無水乙醇處理種子1 min后，放入1%的NaClO中浸泡10 min，用無菌水沖洗5-6次后接種于萌發(fā)培養(yǎng)基上。

1.2.2 轉(zhuǎn)化菌的活化及擴(kuò)培 將含有pPZP221（35s-sNK-nos）和pPZP221（35s-sNK-E8i-nos）的農(nóng)桿菌LBA4404分別接種于含100 mg/L利福平（Rif）+100 mg/L壯觀霉素（Spec）的YEB固體培養(yǎng)基上，28℃劃線培養(yǎng)48 h；挑取單菌落于含有相同抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；至OD600=0.3-0.4時，取2 mL活化菌接種到50 mL相同抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃180 r/min培養(yǎng)5-8 h；取出菌液，5 000 r/min離心10 min，棄去YEB上清液；用10 mL 0.01 mol/L的MgSO4懸浮菌體，5 000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌體；用不含蔗糖的MS液體培養(yǎng)基稀釋至OD600=0.3-0.4，即可用于轉(zhuǎn)化。

1.2.3 農(nóng)桿菌侵染煙草葉盤外植體 取無菌苗幼葉，切成0.5 cm2的外植體，葉背朝上，放置于YN培養(yǎng)基上；2 d后將其放入制備好的菌液中侵染20 min；將侵染后的外植體接種在YN培養(yǎng)基上，25℃共培養(yǎng)2 d；無菌水沖洗2次后放入含Cef 250 mg/L的無菌水中浸泡10 min，將外植體于無菌濾紙上吸干水分，接種于YN++培養(yǎng)基上，葉背向上，25℃黑暗條件下培養(yǎng)10 d后，16 h/8 h明暗交替光照培養(yǎng)，

待芽長到2 cm時轉(zhuǎn)入GN++培養(yǎng)基。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因煙草植株鑒定 采用SDS法提取煙草植株總DNA，設(shè)計(jì)sNK基因特異性引物sNK-F/R（表1）進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含模板100 ng，引物sNK-F/R（5 μmol/L）各2 μL，4×dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μL，rTaq酶（5 U/μL）0.125 μL，滅菌水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)；72℃保溫5 min。反應(yīng)完畢后取10 μL PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

表1 引物序列

1.2.5 轉(zhuǎn)基因煙草植株納豆激酶基因表達(dá)量檢測用TaKaRa RNA提取試劑盒提取PCR陽性煙草植株總RNA。用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA：以500 ng總RNA為模板，加入2 μL試劑盒中所帶有的5×PrimeScript RT Master Mix，再加RNase Free dH2O至10 μL；混勻后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件為：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 10 min。

以cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR，引物、預(yù)期產(chǎn)物長度、反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與鑒定轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測相同。

1.2.6 sNK與sNK-E8i 基因在煙草中表達(dá)量的比較 以cDNA為模板，隨機(jī)選取RT-PCR呈陽性的轉(zhuǎn)sNK煙草植株和轉(zhuǎn)sNK-E8i煙草植株各3株，以Actin 基因作為定量的內(nèi)參基因，以sNKQ-F/R為目的基因引物，用TaKaRa 公司SYBR Premix Ex TaqII染料法熒光定量試劑盒進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR），每個處理均重復(fù)3次，H2O為空白對照。反應(yīng)體系為 25 μL，包含12.5 μL 2× SYBR? Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）溶液、正向和反向引物各加入1 μL（5 μmol/L）、1 μL cDNA（50 ng/μL）和9.5 μL 滅菌雙蒸水。反應(yīng)條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)；4℃ 10 min。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因煙草植株納豆激酶酶活檢測 根據(jù)Astrup等［11］報道的方法，以纖維蛋白原、凝血酶為原料，經(jīng)過改良，用巴比妥那-鹽酸緩沖液制作纖維蛋白平板。以尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將尿激酶用生理鹽水稀釋為1、2、3、4、5、6、7和8 U/mL，每個濃度取10 μL點(diǎn)在已制備好的瓊脂糖-纖維蛋白平板上，每個濃度做3個重復(fù)，加平皿蓋正置于37℃，保溫20 h。測量溶圈直徑，計(jì)算溶圈面積，重復(fù)測量3次，求得平均值。以測定的溶圈面積對標(biāo)準(zhǔn)品不同酶活力作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。取PCR及RT-PCR檢測均為陽性的煙草植株，用PBS法［12］粗提煙草葉片總蛋白；取煙草蛋白粗提液10 μL點(diǎn)在纖維蛋白平板上后，置于37℃培養(yǎng)箱，20 h后，根據(jù)溶圈的面積同標(biāo)準(zhǔn)曲線相比測定酶活力。

1.2.8 轉(zhuǎn)基因煙草植株的加代培養(yǎng) 由于本試驗(yàn)所用的表達(dá)載體為pPZP221，其上帶有Gen植物抗性基因標(biāo)記，可對Gen產(chǎn)生抗性，因此我們選取Gen對轉(zhuǎn)納豆激酶基因煙草NC89 T0代種子進(jìn)行抗生素篩選。首先對篩選培養(yǎng)基中抗生素的濃度進(jìn)行確定，將野生型煙草NC89種子分別接種在Gen濃度為100、200、300和400 mg/L的篩選培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，每個梯度處理接種30個種子，3組重復(fù)，20 d后觀察出芽率及正常植株所占比例，選取最適濃度范圍，然后用相同的方式縮小梯度范圍，最終確定篩選培養(yǎng)基中抗生素的最適濃度。隨后，將轉(zhuǎn)納豆激酶基因煙草NC89 T0代種子接種于篩選培養(yǎng)基上，30 d后長出的苗子轉(zhuǎn)到MS基本培養(yǎng)基上，待煙葉量足夠時，提取煙草總DNA，以sNK-F/R引物對其進(jìn)行PCR檢測，得到的陽性苗進(jìn)行扦插擴(kuò)繁移栽組培室。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因煙草植株的獲得

用 含 質(zhì) 粒pPZP221（35s-sNK-nos），pPZP221（35s-sNK-E8i-nos）的根癌農(nóng)桿菌LBA4404分別侵染煙草品種NC89的幼葉切片，侵染后的煙草葉片經(jīng)共培養(yǎng)、脫菌處理后，置于選擇培養(yǎng)基上，約20 d后，外植體周圍出現(xiàn)愈傷組織并有綠色芽點(diǎn)形成。45 d

左右時，待芽長到2 cm時，切下幼芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，其后約1個月左右生根成苗（圖1）。以含目的基因的質(zhì)粒pUC57-sNK為陽性對照，野生型植株葉片總DNA為陰性對照，H2O為空白對照，以sNK基因特異性引物進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示，有12株轉(zhuǎn)sNK基因煙草植株和10株轉(zhuǎn)sNK-E8i基因煙草植株總DNA擴(kuò)增產(chǎn)物與陽性質(zhì)粒一致，兩者PCR產(chǎn)物相同，均為484 bp的特異性條帶（圖2），初步證明目的基因已整合到煙草基因組中。得到的陽性植株，進(jìn)行扦插擴(kuò)繁，移栽至花盆中，組培室室內(nèi)培養(yǎng)。

圖 1 組織培養(yǎng)各階段

圖 2 轉(zhuǎn)sNK基因、sNK-E8i基因煙草植株的PCR檢測

2.2 RT-PCR檢測

取PCR檢測呈陽性的煙草植株葉片，提取葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果（圖3）顯示，有9株轉(zhuǎn)sNK基因煙草植株（T01-T09）和10株轉(zhuǎn)sNK-E8i基因煙草植株（T010-T019）擴(kuò)增產(chǎn)物與陽性質(zhì)粒一致，表明其在轉(zhuǎn)錄水平上有納豆激酶基因的表達(dá)。

圖3 轉(zhuǎn)sNK基因、sNK-E8i基因煙草植株的RT-PCR檢測

2.3 RT-qPCR

隨機(jī)選取RT-PCR呈陽性的轉(zhuǎn)sNK基因煙草植株（T01、T04和T09）和轉(zhuǎn)sNK-E8i基因煙草植株（T010、T013和T015）各3株，進(jìn)行RT-qPCR，對比其表達(dá)量。圖4顯示，轉(zhuǎn)sNK-E8i基因的植株中納豆激酶的表達(dá)量比轉(zhuǎn)sNK基因的植株中高。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明P＜0.05，兩者之間存在顯著性差異。

圖4 sNK 基因與sNK-E8i基因在煙草中相對表達(dá)量

2.4 轉(zhuǎn)基因煙草植株納豆激酶酶活檢測

根據(jù)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品纖溶性（圖5）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果（圖6）顯示，R2=0.983 8，說明尿激酶酶活力與溶圈面積具有較高的線性相關(guān)性。取RT-PCR

呈陽性的30 d齡煙草植株葉片0.1 g，用200 μL PBS緩沖液提取葉片總蛋白，用纖維蛋白平板法檢測酶活性。結(jié)果（圖7）顯示，有5株轉(zhuǎn)sNK基因煙草植株（T01、T02、T05、T07和T09）和3株轉(zhuǎn)sNKE8i基因煙草植株（T011、T012和T013）檢測到溶圈，分別占所檢測植株的56%和30%。根據(jù)溶圈的面積同標(biāo)準(zhǔn)曲線相比測定酶活力，結(jié)果如表2所示。

圖 5 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品纖溶活性

圖 6 尿激酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖7 轉(zhuǎn)基因植株纖溶活性測定

表2 纖維蛋白平板法測得酶活

2.5 轉(zhuǎn)納豆激酶煙草植株的加代培養(yǎng)

2.5.1 煙草NC89 Gen本底抗性水平測定試驗(yàn) 表3顯示，當(dāng)培養(yǎng)基Gen濃度高于100 mg/L時，出芽率明顯降低，且正常苗比例極低。因此，選取0-100 mg/L Gen濃度范圍內(nèi)，以10 mg/L為一個梯度，再次以同樣的方式進(jìn)行篩選，最終確定篩選培養(yǎng)基中Gen濃度為50 mg/L（表4）。

2.5.2 T1代轉(zhuǎn)sNK、sNK-E8i基因煙草植株的獲得取T01、T02、T05、T07、T09、T011、T012和T013植株的種子各50粒，經(jīng)無菌處理后，分別接種于Gen篩選培養(yǎng)基上，對得到的抗性植株進(jìn)行PCR檢測，獲得了T1代轉(zhuǎn)基因煙草植株。

3 討論

自1986年，Barta等［13］首次利用植物表達(dá)系統(tǒng)成功生產(chǎn)人生長激素后，由于利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥用蛋白具有經(jīng)濟(jì)、安全、副作用小、有些植物材料可直接食用等優(yōu)點(diǎn)，日益成為國際上植物基因工程的一個新的發(fā)展趨勢。而利用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白往往會面臨外源基因表達(dá)量低的問題。影響外源蛋白在植物中表達(dá)的因素有很多，如表達(dá)系統(tǒng)的選擇、啟動子的選擇、mRNA的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的效率等。因此，我們選擇從密碼子改造和插入內(nèi)含子兩方面對納豆激酶基因進(jìn)行優(yōu)化。植

物中遺傳密碼子的使用頻率與動物、微生物不同，適當(dāng)?shù)貙⑼庠椿虻拿艽a子替換成為植物偏愛的密碼子，能顯著提高該基因在植物中的表達(dá)水平。而根據(jù)文獻(xiàn)報道，內(nèi)含子在增加mRNA的穩(wěn)定性和增加基因表達(dá)量方面起到正調(diào)節(jié)作用［14-16］。

表3 不同質(zhì)量濃度Gen對煙草植株生長的影響

表4 低質(zhì)量濃度Gen對煙草植株生長的影響

本研究將人工合成的納豆激酶基因sNK和sNKE8i轉(zhuǎn)化到模式植物煙草中，共得到了22株含有目的基因的T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株。RT-PCR結(jié)果顯示，構(gòu)建的兩個基因均在mRNA水平上有表達(dá)，表明我們所合成的基因可在植物中正常轉(zhuǎn)錄。并且由RT-qPCR結(jié)果可知，轉(zhuǎn)sNK-E8i基因的植株中納豆激酶的表達(dá)量比轉(zhuǎn)sNK基因的植株中高。由于本研究構(gòu)建的兩個植物表達(dá)載體除E8內(nèi)含子外沒有任何差異，農(nóng)桿菌侵染的受體材料完全相同，納豆激酶表達(dá)量的提高應(yīng)該是由于E8內(nèi)含子介導(dǎo)的增強(qiáng)效應(yīng)的結(jié)果，說明內(nèi)含子在克服植物生物反應(yīng)器中外源基因表達(dá)量低［17-20］的問題中可以起到增強(qiáng)子的作用。另外，纖維蛋白平板法測定酶活試驗(yàn)結(jié)果證明，本研究已獲得有納豆激酶活性的轉(zhuǎn)sNK基因和轉(zhuǎn)sNKE8i基因 T0代煙草轉(zhuǎn)基因植株，證明以煙草為生物反應(yīng)器生產(chǎn)納豆激酶是可行的。為下一步得到穩(wěn)定遺傳的純合植株，我們通過Gen篩選和PCR鑒定，進(jìn)行了加代得到了T1代轉(zhuǎn)基因煙草植株。

4 結(jié)論

根據(jù)植物偏愛密碼子人工合成的納豆激酶基因和其中插入番茄果實(shí)特異表達(dá)基因E8第一內(nèi)含子的納豆激酶基因在轉(zhuǎn)基因煙草中可表現(xiàn)出較高活性，經(jīng)加代培養(yǎng)已得到T1代轉(zhuǎn)化基因植株。

［1］Sumi H, Hamada H, Tsushima H, et al. A novel fibrinolytic enzyme（nattokinase）in the vegetable cheese Natto；a typical and popular soybean food in the Japanese diet［J］. Experientia, 1987, 43（10）：1110-1111.

［2］Nakamura T, Yamagata Y, Ichishima E. Nucleotide sequence of the subtilisin NAT gene, aprN, of Bacillus subtilis（natto）［J］. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1992, 56（11）：1869-1871.

［3］張淑梅, 李晶, 王玉霞, 等.納豆激酶基因的表達(dá)及純化［J］.生物技術(shù), 2004, 13（6）：12-15.

［4］黃磊, 謝玉娟, 李申, 等.納豆激酶基因的克隆及其在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中的表達(dá)［J］.食品科學(xué), 2007, 28（5）：199-202.

［5］蔡立濤, 徐祥, 王婷婷, 等.納豆激酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)純化及抗體制備［J］.中國生化藥物雜志, 2010（1）：10-13.

［6］張鋒.納豆激酶植物表達(dá)載體的構(gòu)建及番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立［D］. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué), 2005.

［7］張靜.重組納豆激酶基因在雙子葉植物中的轉(zhuǎn)化與表達(dá)［D］.武漢：湖北大學(xué), 2009.

［8］范三紅, 郭藹光, 單麗偉, 等.擬南芥基因密碼子偏愛性分析［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2003, 30（2）：221-225.

［9］于志芬, 李瑞芳.同義密碼子的使用偏好性對蛋白質(zhì)折疊速率的影響［J］.生物物理學(xué)報, 2013, 29（8）：603-613.

［10］Xia X. How optimized is the translational machinery in Escherichia coli, Salmonella typhimurium and Saccharomyces cerevisiae?［J］. Genetics, 1998, 149（1）：37-44.

［11］Astrup T, Müllertz S. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity［J］. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1952, 40（2）：346-351.

［12］孟春曉, 高政權(quán).鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白提取和純化工藝研究進(jìn)展［J］.食品研究與開發(fā), 2007, 28（9）：151-154.

［13］Barta A, Sommergruber K, Thompson D, et al. The expression of a nopaline synthase—human growth hormone chimaeric gene in transformed tobacco and sunflower callus tissue［J］. Plant Molecular Biology, 1986, 6（5）：347-357.

［14］Fiume E, Christou P, Gianì S, et al. Introns are key regulatory elements of rice tubulin expression［J］. Planta, 2004, 218（5）：693-703.

［15］Kawaguchi R, Bailey-Serres J. Regulation of translational initiation in plants［J］. Current Opinion in Plant Biology, 2002, 5（5）：460-465.

［16］Maas C, Laufs J, Grant S, et al. The combination of a novel stimulatory element in the first exon of the maize Shrunken-1 gene with the following intron 1 enhances reporter gene expression up to 1000-fold［J］. Plant Molecular Biology, 1991, 16（2）：199-207.

［17］Mun JH, Lee SY, Yu HJ, et al. Petunia actin-depolymerizing factor is mainly accumulated in vascular tissue and its gene expression is enhanced by the first intron［J］. Gene, 2002, 292（1）：233-243.

［18］Jeong YM, Mun JH, Kim H, et al. An upstream region in the first intron of petunia actin-depolymerizing factor 1 affects tissue specific expression in transgenic Arabidopsis（Arabidopsis thaliana）［J］. The Plant Journal, 2007, 50（2）：230-239.

［19］de Sousa SM, del Giúdice Paniago M, Arruda P, et al. Sugar levels modulate sorbitol dehydrogenase expression in maize［J］. Plant Molecular Biology, 2008, 68（3）：203-213.

［20］程世軍, 葛鴻飛.在轉(zhuǎn)基因水稻植株中蠟質(zhì)基因第1內(nèi)含子對基因表達(dá)影響的分析［J］.植物生理學(xué)報, 2001, 27（5）：381-386.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Research of Transferred Synthetic Nattokinase Gene in Tobacco Genome

Liu Jinglei Zhang Yan Sun Xiaolei Han Lan Kh.Mandakhtsetsen Hasi Agula
（Inner Mongolia Key Laboratory of Herbage ＆ Endemic Crop Biotechnology，College of Life Sciences，Inner Mongolia University，Huhhot 010021）

The nattokinase gene sNK which was artificially synthesized according to plant preferential codons, and the nattokinase gene sNK-E8i which has been got by inserting the first intron of tomato specifically expressed gene E8 into sNK, were transformed into tobacco NC89 through Agrobacterium-mediated method. 12 strains of sNK transgenic tobacco plants and 10 strains of sNK-E8i transgenic tobacco plants were acquired through PCR test. It preliminarily demonstrated that the target genes were integrated into tobacco genomes. It was found that 9 strains of sNK transgenic tobacco plants and 10 strains of sNK-E8i transgenic tobacco plants were positive by using RT-PCR. The result showed that the expression level of sNK-E8i transgenic tobacco plants was higher compared with that of sNK transgenic tobacco plants by RT-qPCR. Besides, the enzyme activity was tested through agarose-fibrin plate analysis, and the dissolving circles of 5 strains of sNK transgenic tobacco plants and 3 strains of sNK-E8i transgenic tobacco plants were detected. The result showed that target genes could be transcribed and translated normally in a part of transgenic tobacco and presented the activity of thrombolysis. The T1transgenic straints were obtained by generation-adding cultivation.

Nattokinase Synthetic Plant preferential codon Tobacco Agarose-fibrin plate analysis

2014-03-03

內(nèi)蒙古自治區(qū)“草原英才”工程資助項(xiàng)目（內(nèi)組通字［2013］17號）

劉靚蕾，女，碩士，研究方向：植物分子生物學(xué)及基因工程；E-mail：472304231@qq.com

哈斯阿古拉，男，博士，教授，研究方向：植物分子生物學(xué)及基因工程；E-mail：hasind@sina.com