王雪梅，尚德浩，潘亞萍

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙體牙髓科，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧省口腔醫(yī)學(xué)研究所牙體牙髓病學(xué)研究室，沈陽110002；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院種植科，沈陽110002；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙周科，沈陽110002）

姜黃素對(duì)脂多糖刺激成骨細(xì)胞骨吸收的影響

王雪梅1，尚德浩2，潘亞萍3

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙體牙髓科，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧省口腔醫(yī)學(xué)研究所牙體牙髓病學(xué)研究室，沈陽110002；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院種植科，沈陽110002；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙周科，沈陽110002）

目的通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法探討姜黃素對(duì)脂多糖（LPS）刺激成骨細(xì)胞后骨保護(hù)因子（OPG）和破骨細(xì)胞核因子κB受體活化因子配基（RANKL）mRNA表達(dá)的影響。方法1 μg/mL LPS作用成骨細(xì)胞6、12、18、24、48 h，并用10 μmol/L姜黃素預(yù)處理成骨細(xì)胞60 min后加入1 μg/mL LPS繼續(xù)作用6、12、18、24、48 h，RT-PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞OPG和RANKLmRNA的表達(dá)。結(jié)果當(dāng)以1 μg/mL LPS作用于成骨細(xì)胞，隨著作用時(shí)間的增加成骨細(xì)胞表達(dá)RANKLmRNA的能力逐漸增強(qiáng)，到24 h達(dá)到最高峰，到48 h基本恢復(fù)至初始水平；用10 μmol/L姜黃素預(yù)處理成骨細(xì)胞，然后再用1 μg/mL LPS處理成骨細(xì)胞48 h，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞表達(dá)RANKLmRNA的能力明顯減弱，隨著作用時(shí)間的增加成骨細(xì)胞表達(dá)RANKLmRNA的能力變化不明顯。當(dāng)以1 μg/mL LPS作用于成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞表達(dá)OPGmRNA的能力無明顯變化；用10 μmol/L姜黃素預(yù)處理成骨細(xì)胞，然后再用1 μg/mL LPS處理成骨細(xì)胞48 h，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞表達(dá)OPGmRNA的能力也無明顯變化。結(jié)論姜黃素可以減少LPS刺激后成骨細(xì)胞RANKLmRNA的表達(dá)，對(duì)OPGmRNA表達(dá)無影響，進(jìn)而使得RANKL/OPG的比值減小，抑制骨吸收。

姜黃素；脂多糖；骨保護(hù)因子；破骨細(xì)胞核因子κB受體活化因子配基

細(xì)胞壁脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性厭氧菌內(nèi)毒素的主要成分，當(dāng)發(fā)生慢性根尖周炎或牙周炎時(shí)，LPS打破骨吸收和骨沉積的平衡狀態(tài)，出現(xiàn)骨喪失。它不僅可以刺激細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，使單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等向破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化，而且可以促進(jìn)成熟的破骨細(xì)胞存活，刺激骨吸收。LPS還可以直接作用于成骨細(xì)胞產(chǎn)生大量的破骨細(xì)胞核因子κB受體活化因子配基（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL），它們與來自于血液或局部的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的破骨細(xì)胞核因子κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）結(jié)合，啟動(dòng)骨保護(hù)因子（osteoprotegerin，OPG）/RANKL/RANK信號(hào)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和成熟，使破骨活動(dòng)增強(qiáng)，導(dǎo)致牙槽骨吸收，LPS是牙槽骨病理性吸收的關(guān)鍵因素。

大量研究證明，姜黃素具有抗氧化［1］、抗誘變、抗腫瘤［2］、抗炎［3］、清除自由基、抗微生物等多方面作用，在過去20年的研究中，姜黃素在多種細(xì)胞中顯示了抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性，但在口腔領(lǐng)域的研究還很少。Guimar?es等［4］研究發(fā)現(xiàn)口服姜黃素可以降低LPS引起的實(shí)驗(yàn)性鼠牙周炎的免疫炎性反應(yīng)，并且有研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制LPS對(duì)多種細(xì)胞的損傷作用［5～12］，因此本實(shí)驗(yàn)選用LPS作為外源性刺激物作用于體外原代培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測(cè)姜黃素對(duì)LPS刺激成骨細(xì)胞OPG和RANKLmRNA表達(dá)的影響，以期證明姜黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)骨吸收有抑制作用，為姜黃素治療牙周炎和根尖周炎提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生24 h內(nèi)的SD胎鼠，雌雄不限，體質(zhì)量約6 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。

1.2 主要試劑

Ⅰ型膠原酶、姜黃素、LPS、MTT（美國(guó)Sigma公司）；高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司）；胰蛋白酶（華美公司）；RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）。

1.3 成骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)

取新生的SD胎鼠顱骨剪成碎片，胰蛋白酶消化，Ⅰ型膠原酶消化進(jìn)行成骨細(xì)胞培養(yǎng)，以1∶2進(jìn)行傳代，每隔2 d換液1次，5～7 d進(jìn)行傳代［13］。

1.4 RT-PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞OPG和RANKLmRNA的表達(dá)

取第3～4代成骨細(xì)胞按5×103/cm2的密度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，加入1 μg/mL LPS繼續(xù)作用6、12、18、24和48 h，然后用10 μmol/L姜黃素預(yù)處理60 min后加入1 μg/mL LPS持續(xù)作用6、12、18、24和48 h，分別在各時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，保存于-80℃冰箱中，留待RT-PCR實(shí)驗(yàn)所用。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，共擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。RANKL引物序列：上游5′-TACTTTCGAGCGCAGATGGAT-3′，下游5′-GTACGCTTCCCGATGTTTCAT-3′，產(chǎn)物大小為482 bp；OPG引物序列：上游5′-AAACAGCACTGCACAG TGAG-3′，下游5′-TGGTAGGAACAGCAAACCTG-3′，產(chǎn)物大小為489 bp；GAPDH引物序列：上游5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游5′-CTCGCT CCTGGAAGATGGTG-3′，產(chǎn)物大小為250 bp。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS10.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用t檢驗(yàn)對(duì)比各時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS刺激成骨細(xì)胞后RANKLmRNA的表達(dá)

RT-PCR的結(jié)果表明，LPS增強(qiáng)成骨細(xì)胞表達(dá)RANKLmRNA呈時(shí)間依賴性。成骨細(xì)胞基礎(chǔ)表達(dá)少量RANKLmNRA及較強(qiáng)OPGmNRA。當(dāng)以1 μg/mL LPS作用于成骨細(xì)胞48 h，隨著作用時(shí)間的增加成骨細(xì)胞表達(dá)RANKLmRNA的能力逐漸增強(qiáng)，到24 h達(dá)到最高峰，24 h后成骨細(xì)胞表達(dá)RANKLmRNA的水平開始下降，到48 h基本恢復(fù)至初始水平（圖1）。

圖1 RT?PCR檢測(cè)LPS刺激后成骨細(xì)胞RANKL mRNA的表達(dá)Fig.1 Expression of RANKL mRNA after LPS stimulation in osteoblasts by RT?PCR

2.2 姜黃素對(duì)LPS刺激成骨細(xì)胞后RANKLmRNA表達(dá)的影響

用10 μmol/L姜黃素預(yù)處理成骨細(xì)胞60 min，然后再用1 μg/mL LPS處理成骨細(xì)胞48 h，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞表達(dá)RANKLmRNA的能力較LPS刺激組明顯減弱，隨著作用時(shí)間的增加成骨細(xì)胞表達(dá)RANKLmRNA的能力變化不明顯（圖2）。

2.3 姜黃素對(duì)LPS刺激成骨細(xì)胞后OPGmRNA表達(dá)的影響

圖2 RT?PCR檢測(cè)姜黃素對(duì)LPS刺激后RANKL mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Expression of RANKL mRNA in osteoblasts with curcumin preconditioned plus LPS stimulation by RT?PCR

當(dāng)以1 μg/mL LPS作用于成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞表達(dá)OPGmRNA的能力無明顯變化，當(dāng)用10 μmol/L姜黃素預(yù)處理成骨細(xì)胞，然后再用1 μg/mL LPS處理成骨細(xì)胞48 h，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞表達(dá)OPGmRNA的能力也無明顯變化（圖3）。

圖3 姜黃素對(duì)LPS刺激后OPG mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Expression of OPG mRNA in osteoblasts with curcumin preconditioned plus LPS stimulation by RT?PCR

3 討論

近幾年的研究認(rèn)為，骨組織的代謝是通過成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共同完成的，然而破骨細(xì)胞表面的受體非常少，其啟動(dòng)、功能激活到最后凋亡都需要成骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)。成骨細(xì)胞分泌OPG和RANKL兩種物質(zhì)調(diào)節(jié)骨代謝，二者的比值是成骨細(xì)胞促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的決定性因素。RANKL一旦與RANK結(jié)合就會(huì)刺激前體破骨細(xì)胞分化，活化成熟的破骨細(xì)胞，引起骨吸收［14］。OPG通過阻礙RANKL與RANK的結(jié)合抑制破骨細(xì)胞的形成［15］。在多種微環(huán)境條件下，由于OPG對(duì)RANKL的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合能力比RANK更強(qiáng)，可以結(jié)合或中和可溶性RANKL以及與基質(zhì)細(xì)胞/成骨細(xì)胞結(jié)合的RANKL，通過該機(jī)制阻斷RANKL與破骨譜系細(xì)胞（破骨前體細(xì)胞和破骨細(xì)胞）表面的RANK結(jié)合，從而抑制骨吸收［16，17］。因此OPG和RANKL是骨代謝的最終效應(yīng)因子。OPG/ RANKL/RANK在骨重建過程中偶聯(lián)了骨形成和骨吸收的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，組成了破骨細(xì)胞的三角調(diào)控系統(tǒng)，同時(shí)它們也是破骨細(xì)胞分化、活化、成熟及凋亡過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［18］。其中，RANKL和OPG的比值是控制骨重建的關(guān)鍵因素［18～20］。

維持骨代謝的動(dòng)態(tài)平衡需要成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的相互作用，許多激素和細(xì)胞因子共同組成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)參與此動(dòng)態(tài)過程的調(diào)控。LPS、維生素D3和一些促炎性細(xì)胞因子，都可通過上調(diào)RANKL的表達(dá)和下調(diào)OPG的表達(dá)使得破骨細(xì)胞增多［21］。

本研究結(jié)果顯示：大鼠成骨細(xì)胞基礎(chǔ)表達(dá)較強(qiáng)OPGmRNA和少量RANKLmRNA，LPS刺激大鼠成骨細(xì)胞時(shí)，其表達(dá)RANKLmRNA的能力均比未受刺激的細(xì)胞增強(qiáng)，與Kikuch等［22～25］的結(jié)果一致。我們發(fā)現(xiàn)隨著LPS作用時(shí)間的延長(zhǎng)，RANKLmRNA的表達(dá)逐漸增加，到24 h達(dá)到最高峰，到48 h降至初始狀態(tài)，由于LPS刺激6 h成骨細(xì)胞表達(dá)RANKLmNRA能力明顯改變，表明LPS的刺激作用可能是直接刺激細(xì)胞的結(jié)果，而不是成骨細(xì)胞分泌的其他細(xì)胞因子的間接作用；LPS對(duì)于大鼠成骨細(xì)胞OPGmRNA的表達(dá)無明顯作用，說明LPS是通過激活牙槽骨中成骨細(xì)胞的OPG/RANKL/RANK傳導(dǎo)通路，增加了RANKL/OPG比值從而誘導(dǎo)牙槽骨吸收。而用10 μmol/L姜黃素預(yù)處理成骨細(xì)胞，再用1 μg/mL LPS處理成骨細(xì)胞48 h，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞表達(dá)RANKLmRNA的能力明顯減弱，提示姜黃素抑制了LPS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞RANKLmRNA表達(dá)升高，但是隨著作用時(shí)間的增加成骨細(xì)胞表達(dá)OPGmRNA的能力變化不明顯，因此RANKL/OPG比值減小，姜黃素從而抑制了骨吸收，為姜黃素治療牙周炎和根尖周炎提供理論依據(jù)。

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（編輯 陳姜）

EffectofCurcumin on Bone Resorption Stimulated by Lipopolysaccharide in Osteoblasts

WANGXue-mei1，SHANGDe-hao2，PANYa-ping3
（1.Departments ofEndodentics，CenterExperimentalDepartment，SchoolofStomatology，China MedicalUniversity，Institution ofOralMedicine ofLiaoning，Shenyang 110002，China；2.Center of Implantology，School of Stomatology，China Medical University，Shenyang 110002，China；3.Periodontics，School of Stomatology，China MedicalUniversity，Shenyang 110002，China）

ObjectiveTo investigate the effect of curcumin on the expression of osteoprotegerin（OPG）and receptor activator of nuclear factor-κB ligand（RANKL）mRNA stimulated by lipopolysaccharide（LPS）in osteoblasts by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）.MethodsOsteoblasts with/without10μmol/L curcumin precondition were treated with 1μg/mLLPS for6，12，18，24，48 h.RT-PCR was employed to detect the mRNA expression ofOPGandRANKL.ResultsAtime dependentincrease inRANKLmRNA expression was observed in 24 h when cells were treated with 1 μg/mL LPS.The level ofRANKLmRNA began to decrease after 24 h.The expression ofRANKLmRNA in osteoblasts was similaras thatin untreated controlsat48 h.Before exposure to LPS，osteoblasts were pretreated with 10μmol/Lcurcumin，the expression ofRANKLmRNA decreased significantly and exhibited no time dependent relationship，the level ofRANKLmRNA slightly changed.The level ofOPGmRNA slightly changed when osteoblasts either treated with 1 μg/mL LPS or 10 μmol/L curcumin preconditioned until 48 h.ConclusionCurcumin suppressed bone resorption by downregulate the expression ofRANKLmRNAinduced by LPS in osteoblastsand had no effecton thatofOPGmRNA.

curcumin；lipopolysaccharide；osteoprotegerin；receptor activator of nuclear factor-κB ligand

R783

A

0258-4646（2014）11-0982-04

遼寧省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013225090）

王雪梅（1976-），女，主治醫(yī)師，博士. E-mail：wangxuemeisdh@hotmail.com

2014-09-09

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