周潔塵 閆瑞坤 王圣潔 何苑皞 譚益明 周?chē)?guó)英

（中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410004）

三種植物乙醇粗提物對(duì)松梢螟幼蟲(chóng)的生物活性研究

周潔塵 閆瑞坤 王圣潔 何苑皞 譚益明 周?chē)?guó)英

（中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410004）

在室內(nèi)測(cè)定了垂序商陸全草、柚果皮、博落回全草乙醇粗提物對(duì)松梢螟幼蟲(chóng)的生物活性，并測(cè)定了其林間防效。結(jié)果顯示，不同濃度3種植物乙醇粗提物對(duì)松梢螟幼蟲(chóng)都有一定的生物活性，且濃度越高作用效果越強(qiáng)。柚皮粗提物對(duì)松梢螟幼蟲(chóng)的生物活性最強(qiáng)，100 mg/mL的柚皮粗提物對(duì)松梢螟幼蟲(chóng)的最高毒殺校正死亡率、拒食率、生長(zhǎng)抑制率分別為80.00%、99.28%和96.32%，同時(shí)其林間防治效果為55.70%，與對(duì)照藥劑噻蟲(chóng)啉的防治效果在同一顯著水平。垂序商陸粗提物對(duì)松梢螟幼蟲(chóng)的生物活性最弱，但其高濃度粗提物校正死亡率仍在70%以上，拒食率以及生長(zhǎng)抑制率也在90%以上。

乙醇粗提物 松梢螟 毒殺作用 拒食作用 生長(zhǎng)抑制作用

馬尾松（Pinus massoniana）是中國(guó)南方地區(qū)重要的綠化鄉(xiāng)土造林樹(shù)種和用材樹(shù)種，經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高且用途廣泛。馬尾松樹(shù)干富含豐富的油脂，是生產(chǎn)松脂的主要樹(shù)種［1］；其木材的耐腐性較好，可以應(yīng)用于多個(gè)輕、重工業(yè)領(lǐng)域，如建筑、涂料、家具、油漆、造紙、橡膠等［2，3］；枝干可用于人工培養(yǎng)茯苓、松蕈等真菌；花粉可入藥［4］。近幾年來(lái)，馬尾松人工造林面積廣，且為追求高額利潤(rùn)而普遍連栽，導(dǎo)致馬尾松林物種多樣性喪失，蟲(chóng)害種類(lèi)繁多且易發(fā)生大面積爆發(fā)［5］。

松梢螟（Dioryctria splendidella），又名鉆心蟲(chóng)，可危害馬尾松頂梢及松球，導(dǎo)致主干彎曲，嚴(yán)重影

響松樹(shù)生長(zhǎng)和松材材質(zhì)以及果實(shí)產(chǎn)量。近年來(lái)，湖南衡山松林松梢螟為害情況嚴(yán)重，且沒(méi)有較有效的防治方法。目前防治松梢螟的方法主要是撫育措施結(jié)合化學(xué)藥劑防治［6］，使用化學(xué)藥劑存在殘留量高，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重等各種弊端。植物殺蟲(chóng)資源豐富，對(duì)環(huán)境、植物本身以及害蟲(chóng)天敵均無(wú)影響，也不易使有害生物產(chǎn)生抗藥性［7，8］，所以植物源殺蟲(chóng)劑成為時(shí)下農(nóng)藥研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。劉海偉［9］研究了菊芋葉片提取物對(duì)棉鈴蟲(chóng)的生物活性，結(jié)果表明菊芋葉片乙酸乙酯提取物對(duì)棉鈴蟲(chóng)的生物活性作用最明顯；李云壽等［10］發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭對(duì)4種儲(chǔ)糧害蟲(chóng)有一定的生物活性；何靜［11］的研究表明了蒼耳提取物對(duì)粘蟲(chóng)有一定的毒殺作用。博落回、垂序商陸全株有毒，近年來(lái)相關(guān)殺蟲(chóng)作用研究逐漸增多［12-14］，周順玉等［15］研究了博落回對(duì)茶毛蟲(chóng)及茶尺蠖的生物作用，何雅薔等［16］測(cè)定了垂序商陸對(duì)赤擬谷盜和玉米象的作用。柚果皮中含有多種活性成分，具有殺蟲(chóng)抑菌作用［17］。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)這3種植物對(duì)油茶炭疽病病原菌均具有一定的抑制作用。

國(guó)內(nèi)對(duì)于防治松梢螟的植物源藥劑的開(kāi)發(fā)也有初步地研究，有研究表明苦參根中含有對(duì)松梢螟幼蟲(chóng)具有顯著毒殺活性的物質(zhì)［18］。本研究探索3種植物垂序商陸（Phytolacca americana L.）全草、柚（Citrus maxima）果皮、博落回（Macleaya cordata）全草的乙醇粗提物對(duì)松梢螟的3、4、5齡幼蟲(chóng)的生物活性作用，以期為基于植物源藥劑的松梢螟防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 垂序商陸全草采集于2012年5-8月，地點(diǎn)為湖南省衡陽(yáng)市衡山縣紫金山林場(chǎng)龍鳳工區(qū)旁；柚皮收集于2012年9-12月，為沙田柚廢棄果皮；博落回全草采集于2012年5-8月，地點(diǎn)為湖南省黃豐橋林場(chǎng)。

1.1.2 供試幼蟲(chóng) 松梢螟幼蟲(chóng)收集于湖南省衡山市紫金山林場(chǎng)龍泉馬尾松幼林。用廣口瓶作為飼養(yǎng)器，瓶中放入經(jīng)60℃烘箱2 h消毒的松梢段，瓶口用紗布封好，培養(yǎng)溫度為27℃左右，相對(duì)濕度為60%-80%。將松梢螟幼蟲(chóng)分批接入飼養(yǎng)器中飼養(yǎng)繁殖，取3、4、5齡幼蟲(chóng)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 植物的預(yù)處理及粗提物的制備 將3種植物洗凈置于陰涼處晾干，然后放在恒溫干燥箱中以60℃的溫度烘干至葉片發(fā)脆。小心取出植物用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩。將獲得干粉稱(chēng)重后置于密封瓶?jī)?nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

采用超聲波提取法［19］進(jìn)行粗提物的制備，提取溶劑為乙醇。分別稱(chēng)取適量3種植物干粉，加入10倍體積（V/W）的90%乙醇浸漬1 d，然后置于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)3℃溫度粉碎振蕩1 h，工作時(shí)間為2 s，間隙時(shí)間為0.5 s，重復(fù)超聲。真空抽濾提取液，棄廢渣，減壓濃縮濾液至恒定重量獲得浸膏狀植物乙醇粗提物。用60%乙醇溶液溶解3種植物粗提物，適量添加0.1%的吐溫-80，分別制成濃度為6.25、12.5、25、50和100 mg/mL的供試溶液。將試驗(yàn)分3組進(jìn)行，分別為P.a垂序商陸粗提物各濃度供試液，C.m柚皮粗提物各濃度供試液，M.c博落回粗提物各濃度供試液。

1.2.2 毒殺作用的測(cè)定 采用浸漬法［20］。挑選健康、生長(zhǎng)狀態(tài)體重基本一致的3齡、5齡幼蟲(chóng)，分別放入不同濃度的植物粗提物中浸漬5 s后取出，設(shè)置清水對(duì)照及30 mg/mL市售噻蟲(chóng)啉陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)濃度處理10頭幼蟲(chóng)，3次重復(fù)。處理后的幼蟲(chóng)用無(wú)藥新鮮松梢段正常飼養(yǎng)，連續(xù)觀(guān)察48 h后記錄試蟲(chóng)死亡頭數(shù)，觀(guān)察蟲(chóng)體中毒癥狀及死亡形態(tài)，計(jì)算校正死亡率。

死亡率（%）=死亡蟲(chóng)數(shù)/總蟲(chóng)數(shù)×100%

校正死亡率（%）=（處理死亡率-對(duì)照死亡率）/（1-對(duì)照死亡率）×100%

1.2.3 拒食作用的測(cè)定 將新鮮直徑大小基本一致的馬尾松梢枝條截成20 mm長(zhǎng)的小段，分別放入不同濃度3種植物乙醇粗提物和清水中浸泡10 s。待松梢段靜置陰干后用于飼喂松梢螟4齡幼蟲(chóng)，幼蟲(chóng)健康且生長(zhǎng)狀況基本一致并經(jīng)過(guò)6 h饑餓處理。3種植物粗提物的不同濃度皆處理10頭幼蟲(chóng)，并重復(fù)3次。連續(xù)觀(guān)察2 d，分別在24 h與48 h時(shí)測(cè)量試蟲(chóng)食物攝入量，并計(jì)算拒食率［21，22］。

1.2.4 生長(zhǎng)抑制作用測(cè)定 采用飼喂稱(chēng)重法［23］。將

直徑大小基本一致的新鮮馬尾松梢枝條截成20 mm長(zhǎng)的小段，分別在不同濃度3種植物乙醇粗提物和清水中浸泡10 s。待松梢段靜置陰干后用于飼喂松梢螟4齡幼蟲(chóng)，幼蟲(chóng)健康且生長(zhǎng)狀況基本一致并經(jīng)過(guò)6 h饑餓處理。3種植物粗提物的不同濃度皆處理10頭幼蟲(chóng)，并重復(fù)3次。用處理松梢段飼喂試蟲(chóng)48 h后清理飼養(yǎng)器，改換無(wú)處理新鮮松梢段飼喂，1 d更換一次，直到試蟲(chóng)化蛹。于24、48和96 h時(shí)稱(chēng)量試蟲(chóng)體重。根據(jù)試蟲(chóng)體重變化情況計(jì)算生長(zhǎng)抑制率［24］。

1.2.5 林間防治效果測(cè)定 試驗(yàn)地點(diǎn)為紫金山林場(chǎng)龍泉村五年生馬尾松幼林樣地。試驗(yàn)方法為以3 d為一個(gè)周期施藥，共施藥12 d，每種植物粗提物施藥15顆馬尾松幼苗，并設(shè)置3個(gè)重復(fù)。同時(shí)以清水和標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥30 mg/mL噻蟲(chóng)啉作為對(duì)照組。噴灑藥液前調(diào)查蟲(chóng)口基數(shù)，分別于施藥后第3天、第7天以及第15天調(diào)查幼苗整株上剩余活蟲(chóng)數(shù)，計(jì)算馬尾松受害株率和松梢螟幼蟲(chóng)防治效果［25，26］。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 用SPSS 18.0和DPS（Data Processing System）數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用Duncan’s法分析數(shù)據(jù)差異顯著性。將拒食率、生長(zhǎng)抑制率和校正死亡率均轉(zhuǎn)化為機(jī)率值，將濃度進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后繪制毒力回歸方程，并計(jì)算AFC50、LC50。

2 結(jié)果

2.1 3種植物乙醇粗提物對(duì)松梢螟幼蟲(chóng)的毒殺作用

不同濃度植物粗提物對(duì)松梢螟5齡幼蟲(chóng)的毒殺結(jié)果（表1）表明，植物粗提物的濃度越高，其毒殺作用越強(qiáng)。其中柚皮乙醇粗提物對(duì)松梢螟5齡幼蟲(chóng)的毒殺作用較強(qiáng)，在最高濃度100 mg/mL時(shí)，其毒殺作用與30 mg/mL噻蟲(chóng)啉的毒殺作用差異不顯著。而在濃度達(dá)50 mg/mL時(shí)，3種植物乙醇粗提物對(duì)試蟲(chóng)的毒殺作用均達(dá)到了60%以上，說(shuō)明這3種植物對(duì)松梢螟5齡幼蟲(chóng)都具有一定的毒殺活性。

表1 三種植物乙醇粗提物對(duì)松梢螟5齡幼蟲(chóng)的毒殺作用結(jié)果

3種植物乙醇粗提物對(duì)松梢螟3齡幼蟲(chóng)的毒殺作用結(jié)果（表2）顯示，柚皮粗提物對(duì)松梢螟3齡幼蟲(chóng)的毒殺作用最為明顯，也與30 mg/mL噻蟲(chóng)啉的毒殺作用處在同一顯著水平。在最高濃度100 mg/mL時(shí)，3種植物粗提物的毒殺作用均達(dá)到90%以上；僅在濃度為6.25 mg/mL時(shí)，3種植物粗提物處理后的3齡幼蟲(chóng)校正死亡率達(dá)50%以上；3種植物乙醇粗提物對(duì)松梢螟3齡幼蟲(chóng)也具有一定的毒殺活性。

表2 三種植物乙醇粗提物對(duì)松梢螟3齡幼蟲(chóng)的毒殺作用結(jié)果

表3顯示，柚皮粗提物對(duì)5齡、3齡幼蟲(chóng)的毒殺中濃度LC50均小于博落回粗提物與垂序商陸粗提物，這說(shuō)明柚皮粗提物具有更強(qiáng)的毒殺作用，與表1和表2的結(jié)果相符合。而表1-表3顯示，3種植物乙醇粗提物對(duì)松梢螟3齡、5齡幼蟲(chóng)均具有一定的毒殺作用，而3齡幼蟲(chóng)的死亡率高于5齡幼蟲(chóng)，說(shuō)明3種植物粗提物對(duì)3齡幼蟲(chóng)的毒殺作用皆?xún)?yōu)于5齡幼蟲(chóng)；每種植物粗提物對(duì)試蟲(chóng)毒殺作用的95%置信限皆不重疊，也說(shuō)明3種植物粗提物對(duì)松梢螟3齡幼蟲(chóng)的毒殺與對(duì)5齡幼蟲(chóng)的毒殺作用差異顯著。

表3 三種植物乙醇粗提物對(duì)松梢螟5齡、3齡幼蟲(chóng)的毒殺毒力分析

2.2 3種植物乙醇粗提物對(duì)松梢螟幼蟲(chóng)的拒食作用

表4中結(jié)果表明，3種植物粗提物對(duì)松梢螟4齡幼蟲(chóng)都有一定的拒食活性，且拒食活性隨粗提物濃度的升高而增強(qiáng)。其中，濃度為100 mg/mL的柚皮粗提物對(duì)松梢螟幼蟲(chóng)的拒食作用在24 h時(shí)達(dá)到99.28%，試驗(yàn)中幼蟲(chóng)在前24 h基本不取食柚皮粗提物處理的松梢段。而在48 h后，3種植物粗提物100 mg/mL濃度對(duì)松梢螟幼蟲(chóng)的拒食作用在90%以上且處于同一顯著水平，3種植物粗提物均表現(xiàn)出較強(qiáng)的拒食活性，這說(shuō)明粗提物中拒食作用有效成分在48 h后仍有較強(qiáng)的作用。

表4 三種植物乙醇粗提物對(duì)松梢螟4齡幼蟲(chóng)的拒食作用結(jié)果

表5 三種植物乙醇粗提物對(duì)松梢螟4齡幼蟲(chóng)的拒食作用毒力分析

通過(guò)拒食作用毒力（表5）分析可知，柚皮乙醇粗提物的拒食中濃度相較而言最低，拒食作用效果最好，且48 h和24 h的95%置信限重復(fù)較大，說(shuō)明48 h與24 h的拒食作用效果差異不顯著。垂序商陸乙醇粗提物與博落回乙醇粗提物的95%置信限

同樣也表現(xiàn)出這點(diǎn)。

表6 三種植物乙醇粗提物對(duì)松梢螟4齡幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)抑制作用結(jié)果

2.3 3種植物乙醇粗提物對(duì)松梢螟幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)抑制作用

表6顯示，不同濃度3種植物乙醇粗提物均能在一定程度上抑制松梢螟4齡幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)，生長(zhǎng)抑制作用隨濃度的增加而增強(qiáng)。其中濃度100 mg/mL柚皮粗提物抑制作用最為明顯，生長(zhǎng)抑制率在處理24 h后達(dá)96.32%；而濃度100 mg/mL垂序商陸粗提物與博落回粗提物對(duì)松梢螟幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)抑制率略低于柚皮提取物，但與之相比仍處于同一顯著水平。

表7 三種植物乙醇粗提物對(duì)松梢螟4齡幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)抑制作用毒力分析

經(jīng)毒力分析發(fā)現(xiàn)，3種植物乙醇粗提物對(duì)松梢螟4齡幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)抑制作用效果沒(méi)有隨時(shí)間推移而減弱。從表6和表7中可以看出，3種植物粗提物在24 h后對(duì)松梢螟幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)抑制作用較96 h后強(qiáng)，但96 h后生長(zhǎng)抑制率仍有90%以上，說(shuō)明3種植物粗提物中的有效成分代謝半衰期較長(zhǎng)，可以長(zhǎng)時(shí)間保持作用效果，而其95%置信限的重疊現(xiàn)象也說(shuō)明了這點(diǎn)。

2.4 3種植物乙醇粗提物林間防治效果測(cè)定

從表8可知，濃度為100 mg/mL的3種植物乙醇粗提物對(duì)松梢螟幼蟲(chóng)的防治均有一定效果，其中柚皮乙醇粗提物對(duì)松梢螟幼蟲(chóng)的林間防治效果最好，與標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥噻蟲(chóng)啉作用效果相當(dāng)。

3 討論

目前，由于環(huán)境的不斷惡化，化學(xué)藥劑對(duì)環(huán)境的影響嚴(yán)重，人們?cè)絹?lái)越多地致力于從天然產(chǎn)物中

提取活性物質(zhì)來(lái)進(jìn)行病害或蟲(chóng)害的防治［27，28］。植物的抑菌殺蟲(chóng)作用是長(zhǎng)期與昆蟲(chóng)和病原菌進(jìn)化產(chǎn)生的結(jié)果，主要依賴(lài)于植物的次生代謝產(chǎn)物［29］。本試驗(yàn)中3種植物對(duì)松梢螟幼蟲(chóng)的毒殺作用較好且作用效果持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，這說(shuō)明3種植物中殺蟲(chóng)活性成分可以被乙醇提取出來(lái)，且活性成分代謝半衰期較長(zhǎng)。本試驗(yàn)毒殺作用的測(cè)定采用的浸蟲(chóng)法，蟲(chóng)體浸入藥液后，藥液可能通過(guò)口器進(jìn)入消化道、也可能通過(guò)氣門(mén)等進(jìn)入蟲(chóng)體，因此毒殺作用是觸殺、胃毒、熏蒸等多種作用的綜合結(jié)果。而本試驗(yàn)僅測(cè)試了拒食作用及生長(zhǎng)發(fā)育作用，并不能說(shuō)明有效成分的具體作用方式。

表8 三種植物乙醇粗提物對(duì)松梢螟蟲(chóng)害的林間防治效果

植物的不同部位含有的有效成分不同，且不同的有效成分提取方法與提取溶劑不盡相同［30-32］，本試驗(yàn)只研究了3種植物的乙醇提取物，且均為粗提物，其有效成分復(fù)雜，為了解對(duì)松梢螟幼蟲(chóng)起到生物作用的主要成分、附效成分及相互間的作用效果，有必要對(duì)高活性物質(zhì)分離純化，分析其活性及化學(xué)成分。在毒殺作用測(cè)定過(guò)程中，3齡幼蟲(chóng)的死亡率明顯高于5齡幼蟲(chóng)，這可能是由于幼蟲(chóng)處在不同的發(fā)育階段，其代謝速率、抗藥性等不同所導(dǎo)致的，具體殺蟲(chóng)機(jī)理也值得深入研究。

3種植物對(duì)松梢螟幼蟲(chóng)均具有較強(qiáng)生物活性，有潛力發(fā)展成植物源藥劑，然而博落回、垂序商陸全株有毒，如果開(kāi)發(fā)成植物源藥劑還必須評(píng)估其對(duì)人畜以及天敵等是否安全。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從垂序商陸全草、柚果皮以及博落回中提取有效物質(zhì)來(lái)進(jìn)行松梢螟幼蟲(chóng)的防治，結(jié)果表明，這3種植物乙醇粗提物對(duì)松梢螟幼蟲(chóng)均有一定的生物活性，柚皮對(duì)松梢螟幼蟲(chóng)的毒殺作用、拒食作用以及生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)，且具有一定的林間防治效果。如開(kāi)發(fā)成植物源農(nóng)藥，對(duì)于林業(yè)害蟲(chóng)的無(wú)公害防治具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Bioactivities of the Alcohol Extracts from Three Plants Against Dioryctria splendidella Larvaes

Zhou Jiechen Yan Ruikun Wang Shengjie He Yuanhao Tan Yiming Zhou Guoying
（Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees（Central South University of Forestry and Technology），Ministry of Education，Changsha 410004）

In order to study the bioactivities of ethanol extracts from Phytolacca americana, Citrus maxima peels and Macleaya cordata against the larvaes of Dioryctria splendidella preliminarily in laboratory, contact toxicity, antifeedant activities and body weight gains of D. splendidella larvaes were determined after treated with 3 ethanol extracts. The results indicated that 3 ethanol extracts with different concentration had some bioactivities against the larvae of D. splendidella, and the higher the extracted concentrations, the more obvious of the bioactivities to the larvaes were. When the concentration of Citrus maxima peels extracts was 100 mg/mL, there were the strongest bioactivities. The contact toxicity corrected mortality, antifeedant rate and growth inhibiting rate reached to 80.00%, 99.28%, and 96.32%, respectively. The control effect in the forest was 55.70%, the same as the pesticides thiacloprid. The ethanol extracts from Phytolacca americana had the lowest bioactivities, but the corrected mortality of ethanol extracts being high concentration were more than 70%, antifeedant rates and growth inhibiting rates were more than 90%.

Ethanol extracts Dioryctria splendidella Contact toxicity Antifeedant activities Growth inhibition

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.020

2014-04-21

林業(yè)公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（201004014）

周潔塵，女，碩士研究生，研究方向：病蟲(chóng)害無(wú)公害防治技術(shù)；E-mail：244756681@qq.com

周?chē)?guó)英，博士，教授，研究方向：森林保護(hù)及森林微生物；E-mail：guoying_zhou66@163.com