黃章科 張藝能 莫忠蓁 周玉萍 黃小玲 田長恩

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 植物抗逆基因功能研究廣州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006）

IQ基序突變對AtIQM1的鈣調(diào)素結(jié)合活性的影響

黃章科 張藝能 莫忠蓁 周玉萍 黃小玲 田長恩

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 植物抗逆基因功能研究廣州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006）

旨在確定IQ基序中關(guān)鍵氨基酸殘基突變對IQM1的CaM結(jié)合活性的影響，利用基因體外定點(diǎn)突變技術(shù)將LQ缺失或?qū)突變成S，并通過酵母雙雜交分析突變蛋白iqm1的CaM結(jié)合活性。結(jié)果顯示，用重組質(zhì)粒pGADT7-IQM1CDS、pGADT7-IQM1Del113-114、pGADT7-IQM1L113S或pGBKT7-CaM5分別轉(zhuǎn)化酵母AH109，未出現(xiàn)自激活現(xiàn)象；用pGADT7-IQM1CDS和 pGBKT7-CaM5共轉(zhuǎn)化酵母能在選擇性培養(yǎng)基（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal）上形成藍(lán)色菌落；而用pGADT7-IQM1Del113-114和pGBKT7-CaM5或pGADT7-IQM1L113S和pGBKT7-CaM5共轉(zhuǎn)化酵母則不能在選擇性培養(yǎng)基（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp）上形成菌落。結(jié)果表明，IQ基序中LQ或者L是IQM1與CaM5結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基。

AtIQM1 IQ基序突變 酵母雙雜交 CaM結(jié)合

植物的生命過程受體內(nèi)外各種信號的調(diào)控。Ca2+是細(xì)胞內(nèi)1個(gè)非常重要的第二信使，它可以調(diào)控多種生理反應(yīng)。鈣調(diào)素（calmodulin，CaM）作為細(xì)胞內(nèi)Ca2+受體，絕大多數(shù)無酶活性，也無轉(zhuǎn)錄因子活性，更不是結(jié)構(gòu)蛋白，只有通過其下游的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白（calmodulin-binding protein，CaMBP）來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能［1-4］。CaMBP與CaM的結(jié)合可分為Ca2+依賴、不依賴和抑制3種類型［3］，IQ基序是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的Ca2+不依賴性CaM結(jié)合結(jié)構(gòu)域（calmodulin-binding domain，CaMBD），其氨基酸序列為IQXXXRGXXXR，其中的I可變?yōu)長、V或M，第6位和11位的R可變?yōu)镵或H，第7位的G同樣缺乏保守性，因此，IQ基序的完整序列可概括為［I，L，V］QXXXRXXXX［R，K］［5］。但是，個(gè)別含IQ基序的蛋白質(zhì)與CaM的結(jié)合也依賴Ca2+［6，7］。在植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5個(gè)含有IQ基序的蛋白質(zhì)家

族［8］：myosin家族［9-11］、CAMTA家族［12，13］、CNGC家族［14，15］、IQD家族［6，16，17］和 IQM 家族［18-20］，分別由17個(gè)、6個(gè)、20個(gè)、33個(gè)和6個(gè)成員組成。IQM家族成員的N-端與豌豆重金屬誘導(dǎo)蛋白6A（該蛋白的編碼基因受重金屬誘導(dǎo)而表達(dá)，但其功能未知）、C-端與天花粉素（一類使核糖體失活、具有RNA結(jié)合活性的小分子蛋白）具有較高的同源性［18］。IQM1（IQ motif containing 1）是IQM家族的1個(gè)成員，由At4g33050編碼，只含1個(gè)IQ基序，通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)證明IQM1在體內(nèi)、外都能與CaM結(jié)合，并通過蛋白截短試驗(yàn)證明IQ基序是其鈣調(diào)素結(jié)合所必需的結(jié)構(gòu)域［20］。為了確證IQM1介導(dǎo)的CaM信號參與植物細(xì)胞生理或生長發(fā)育的調(diào)控，需要構(gòu)建IQ基序中關(guān)鍵氨基酸殘基突變的突變互補(bǔ)載體，轉(zhuǎn)入IQM1基因的突變體中，觀察突變表型的恢復(fù)情況。若突變表型不能恢復(fù)，則說明通過IQ基序與CaM的結(jié)合，即IQM1介導(dǎo)的CaM信號參與了相關(guān)調(diào)控；否則相反。當(dāng)然，在構(gòu)建植物表達(dá)載體前，需要先證實(shí)IQ基序中關(guān)鍵氨基酸殘基點(diǎn)突變或缺失后iqm1的CaM結(jié)合活性。為此，本研究利用基因體外定點(diǎn)突變技術(shù)將IQM1的IQ基序中的關(guān)鍵氨基酸殘基LQ缺失或者將L突變成S，然后利用酵母雙雜交分析突變蛋白iqm1與CaM的結(jié)合活性，旨在確定IQ基序中關(guān)鍵氨基酸殘基突變對IQM1的CaM結(jié)合活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）為Columbia（Col）生態(tài)型、大腸桿菌菌株為DH5α、重組質(zhì)粒pUC19-P35S：eGFP：IQM1、pUC19-P35S：eGFP：CaM5為實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，酵母雙雜交系統(tǒng)（Matchmaker Gal4 Two-Hybrid System3）由中國科學(xué)院華南植物園張明永教授友好轉(zhuǎn)贈(zèng)，Pfu DNA Polymerase購自Fermentas公司，Carrier DNA購自Sigma公司，pMD18-T Simple、膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶、Ex Taq DNA 聚合酶及PCR相關(guān)試劑均為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 IQM1基因的CDS全長序列獲取 以pUC19-P35S：eGFP：IQM1為模板，利用IQM1基因引物（F1：5'-TACCCGGGTATGGGTCTTGAAGTTGGGTC-3'，下劃線部分為Sma I酶切位點(diǎn)；R1：5'-CCATCGATTT AACACTTTACAGCCCTAGGGC-3'，下劃線部分為Cla I酶切位點(diǎn)）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。

1.2.2 pGADT7-IQM1CDS獵物載體的構(gòu)建 切取目的片段所在的凝膠，用膠回收試劑盒回收IQM1 CDS。將回收產(chǎn)物與 pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，挑取氨芐青霉素抗性菌落，進(jìn)行PCR 鑒定。取陽性克隆搖菌，提取質(zhì)粒并用Sma I和Cla I進(jìn)行雙酶切鑒定后送華大基因公司測序。然后，將經(jīng)測序證實(shí)的pMD18-IQM1CDS和pGADT7用Sma I和Cla I雙酶切，電泳后割膠回收目的片段并連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，進(jìn)行菌落PCR鑒定，并進(jìn)一步提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到用于酵母雙雜交的獵物載體pGADT7-IQM1CDS。

1.2.3 IQ基序中LQ缺失和L突變成S的PCR擴(kuò)增及其獵物載體的構(gòu)建 用Pfu DNA Polymerase，以測序證實(shí)過的pMD18-IQM1CDS為模板，分別用LQ缺失 引物（F2：5'-GATGCAGCTGCAACTACGAAGGTGTACAAGAGTTAC-3'，Leu113和Gln114缺失；R2：5'-GTAACTCTTGTACACCTTCGTAGTTGCAGCTGCATC-3'，Leu113和Gln114缺失）和點(diǎn)突變引物（F3：5'-TTGATGCAGCTGCAACTACGTCACAAAAGGTGTACAAG-3'，Leu113突變成Ser；R3：5'-CTTGTACACCTTTTGTGACGTAGTTGCAGCTGCATCAA-3'，Leu113突變成Ser）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序?yàn)椋?5℃ 2 min；95℃ 30 s，62℃/65℃ 30 s，72℃ 4 min，18個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。擴(kuò)增完成后用Dpn I消化有甲基化修飾的模板，體外擴(kuò)增產(chǎn)物因無甲基化修飾而不被消化。模板消化后滅活Dpn I，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，經(jīng)菌落PCR鑒定后搖菌提取質(zhì)粒并經(jīng)酶切鑒定后送華大基因公司測序。然后用Sma I和Cla I對測序驗(yàn)證過的缺失突變質(zhì)粒pMD18-IQM1Del113-114、點(diǎn)突變質(zhì)粒pMD18-IQM1L113S及質(zhì)粒pGADT7，進(jìn)行雙酶切，割膠回收目的片段并連接轉(zhuǎn)化，經(jīng)菌落PCR和質(zhì)粒酶切鑒定，得到酵母雙雜交獵物載體pGADT7-

IQM1Del113-114和pGADT7-IQM1L113S。

1.2.4 CaM5的 PCR 擴(kuò)增及其誘餌載體的構(gòu)建 以pUC19-P35S：eGFP：CaM5為模板，用加有酶切位點(diǎn)的CaM5基因引物（5'-TTGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3'，下劃線部分為EcoR I酶切位點(diǎn)；5'-TGGTCGACTCACTTTGCCATCATAACTTTGAC-3'，下劃線部分為Sal I酶切位點(diǎn)）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序?yàn)椋?4℃ 4 min；94℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸 5 min。此后的載體構(gòu)建方法同1.2.2。用卡那霉素進(jìn)行篩選，EcoR I和Sal I雙酶切鑒定，得到酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-CaM5。

1.2.5 酵母感受態(tài)制備和轉(zhuǎn)化 參考 Clontech 公司Matchmaker Gal4 Two-Hybrid System3的操作方法制備AH109感受態(tài)細(xì)胞，取150 μL分裝于1.5 mL離心管，加入10 mg/mL 單鏈Carrier DNA 5 μL和各種質(zhì)粒（圖3），混勻，再加入600 μL PEG/LiAc溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用），渦旋混勻，于30℃、220 r/min培養(yǎng)30 min，加入70 μL DMSO，顛倒混勻，42℃水浴熱激15 min（每5 min輕混1次），冰上放置2 min后，室溫、12 000 r/min離心5 s，棄上清，用400 μL TE重懸細(xì)胞，涂布于SD/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3-5 d至菌落形成。

1.2.6 酵母雙雜交分析 從上述的SD/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上挑取陽性克隆，涂于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3-5 d，觀察菌落形成情況；再將其上長出的菌落轉(zhuǎn)涂于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3-5 d，觀察菌落顏色變化情況。

2 結(jié)果

2.1 相關(guān)載體的構(gòu)建與鑒定

IQM1基因由AT4G33050編碼，本試驗(yàn)所用的CDS為AT4G33050.3，全長1 467 bp，其中IQ基序位于第二個(gè)外顯子末端（圖1）。盡管已通過Invitrogen的酵母雙雜交系統(tǒng)證實(shí)，IQM1能與CaM結(jié)合［20］，但因本研究采用Clontech的酵母雙雜交系統(tǒng)，所以必須在IQM1的CDS的上下游分別加入合適的酶切位點(diǎn)。用分別添加Sma I和Cla I酶切位點(diǎn)的引物F1+R1，對pUC19-P35S：eGFP： IQM1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以克隆IQM1 CDS，并將其構(gòu)建到pMD18-T，經(jīng)過鑒定，IQM1 CDS未發(fā)生突變（圖2-A）。然后根據(jù)QuikChange?XL Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）的說明，將IQ基序中的關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行突變，構(gòu)建到pMD18-T中，測序結(jié)果顯示，點(diǎn)突變的IQM1的第338位堿基T突變成C，即第113位L（TTA）突變?yōu)镾（TCA）（圖2-B）；缺失突變的IQM1的第337-342位堿基（TTACAA）缺失，即第113、114位氨基酸（L、Q）缺失（圖2-C）。其它部分均不存在突變。最后把構(gòu)建的pMD18-IQM1CDS、pMD18-IQM1Del113-114和pMD18-IQM1L113S通過Sma I和Cla I特異位點(diǎn)定向克隆到pGADT7，構(gòu)建成pGADT7-IQM1CDS、pGADT7-IQM1Del113-114和 pGADT7-IQM1L113S，并經(jīng)Sma I和Cla I雙酶切鑒定。同時(shí)，先將PCR擴(kuò)增的CaM5 CDS克隆到pMD18-T，測序證實(shí)后再通過EcoR I和Sal I定向插入pGBKT7，得到pGBKT7-CaM5，并經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切鑒定。

圖1 IQM1基因的結(jié)構(gòu)及擴(kuò)增引物示意圖

圖2 IQ基序中關(guān)鍵氨基酸殘基點(diǎn)突變或缺失

2.2 關(guān)鍵氨基酸突變對相互作用的影響分析

分別用圖3所示的1-9號質(zhì)粒組合共轉(zhuǎn)化酵母AH109，涂布于培養(yǎng)基SD/-Trp/-Lue，30℃培養(yǎng)4 d，長出菌落（圖3-A），說明質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化成功。將所得轉(zhuǎn)化子分別轉(zhuǎn)涂于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培養(yǎng)基培養(yǎng)，只有1號（陽性對照）和2號（IQM1×CaM5）組合的轉(zhuǎn)化子長出菌落，其他組合的轉(zhuǎn)化子均沒有生長（圖3-B）；進(jìn)而將1號、2號菌落轉(zhuǎn)移到SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal培養(yǎng)基培養(yǎng)，二者均能生長且顯藍(lán)色（圖3-C）。以上結(jié)果說明，IQM1 和CaM5能在酵母細(xì)胞內(nèi)結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄因子GAL4的功能恢復(fù)，激活報(bào)告基因表達(dá)；而3號、4號組合的轉(zhuǎn)化子不能在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培養(yǎng)基上生長，說明IQ基序中LQ缺失或L突變成S后的突變蛋白iqm1不能與CaM5結(jié)合，從而證實(shí)了IQ基序的LQ或L是IQM1與CaM5結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基，且L更為重要。

圖3 酵母雙雜交分析

3 討論

CaM作為細(xì)胞的Ca2+受體，在Ca2+/CaM信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中需通過其靶標(biāo)——CaMBP發(fā)揮作用。當(dāng)前，研究蛋白質(zhì)之間相互作用的技術(shù)方法主要有酵母雙雜交、免疫共沉淀、pull-down、雙分子熒光互補(bǔ)以及串聯(lián)親和純化等方法［21］。Fields 和Song［22］首先發(fā)明酵母雙雜交技術(shù)，由最初研究蛋白間的相互作用擴(kuò)展到研究蛋白和DNA、RNA及其他小分子配體間的相互作用，現(xiàn)已衍生出許多試驗(yàn)系統(tǒng)［23］。IQM1與CaM的結(jié)合活性已被本研究組先后利用Invitrogen［20］和Clontech的酵母雙雜交系統(tǒng)所證實(shí)。并通過蛋白截短試驗(yàn)證明IQ基序是其CaM結(jié)合所必需的結(jié)構(gòu)域［20］；通過基因體外定點(diǎn)突變技術(shù)將其中的LQ缺失或L突變?yōu)镾后所獲得的突變蛋白iqm1都不能與CaM結(jié)合。這說明IQ 基序是IQM1和CaM結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，其中的LQ尤其是L是決定結(jié)合活性的關(guān)鍵氨基酸殘基。本研究結(jié)果為構(gòu)建IQ基序中關(guān)鍵氨基酸殘基點(diǎn)突變或缺失的突變互補(bǔ)載體，轉(zhuǎn)入iqm1突變體，觀察突變體表型恢復(fù)情況，以確證IQM1介導(dǎo)的CaM信號是否參與有關(guān)的生理或生長發(fā)育調(diào)控提供了支撐。相關(guān)思路可資其它CaMBP的功能研究者借鑒。

4 結(jié)論

利用酵母雙雜交系統(tǒng)分析了IQ基序中LQ缺失和L突變成S對于IQM1與CaM5結(jié)合活性的影響，試驗(yàn)結(jié)果說明了無論是LQ缺失或L突變成S后，突變蛋白IQM1都不能與CaM5相互結(jié)合，從而確定了IQ基序的LQ或L是IQM1與CaM5結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Effects of Mutations in IQ Motif of AtIQM1 on Its Calmodulin Binding

Huang Zhangke Zhang Yi’neng Mo Zhongzhen Zhou Yuping Huang Xiaoling Tian Chang’en
（Guangzhou Key Laboratory for Functional Study on Stress-Resistant Genes in Plants，School of Life Sciences，Guangzhou University，Guangzhou 510006）

To confirm the effects of mutation of key amino acid residues in IQ motif of AtIQM1 on its calmodulin binding, the LQ was deleted or L was mutated to S through the mutagenesis technology in vitro. Then calmodulin binding of the mutant protein iqm1 was analyzed via yeast two-hybrid assay. The self-activation was not observed when the recombinant plasmid pGADT7-IQM1CDS, pGADT7-IQM1Del113-114, pGBKT7-CaM5 or pGADT7-IQM1L113Swas transformed into the yeast AH109 strain, respectively. Blue colonies were achieved on the selective agar plates（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal）when pGADT7-IQM1CDSand pGBKT7-CaM5 were co-transformed into AH109 yeast strain. However, the yeasts which were co-transformed with pGADT7-IQM1Del113-114and pGBKT7-CaM5 or pGADT7-IQM1L113Sand pGBKT7-CaM5 were not able to grow on the selective medium（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp）. The results suggest that the LQ or L in IQ motif is required for AtIQM1 to combine with CaM5.

AtIQM1 Mutantion in IQ motif Yeast two hybrid Calmodulin binding

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.021

2014-05-26

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31170204），羊城學(xué)者科研項(xiàng)目（12A001G）

黃章科，男，碩士研究生，研究方向：植物分子遺傳學(xué)；E-mail：huang.zhangke@163.com

田長恩，男，博士，教授，研究方向：植物分子遺傳學(xué)；E-mail：changentian@aliyun.com