王海娟，李慧，王笑峰，王云，邢曉明，羅兵

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266021 1 附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科; 2 微生物學(xué)教研室; 3 附屬醫(yī)院病理科)

鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤(ENKTCL) 是2001年由WHO正式命名的一種非霍奇金淋巴瘤，該病具有獨(dú)特臨床表現(xiàn)以及細(xì)胞形態(tài)、免疫表型和遺傳學(xué)特征，是我國(guó)常見(jiàn)的非霍奇金淋巴瘤亞型之一[1-2]。ENKTCL的發(fā)生與EB病毒(EBV)感染密切相關(guān)，具有地域性，EBV感染是其致病因素還是伴隨現(xiàn)象，目前已成為ENKTCL病因?qū)W的研究熱點(diǎn)[1,3]。不同來(lái)源的EBV毒株在基因變異和生物學(xué)功能方面具有差異性，因此是否存在高致癌性的EBV變異毒株一直倍受關(guān)注。目前對(duì)ENKTCL中EBV基因型別的研究多集中于1/2分型，對(duì)F/f變異和C/D變異的研究較少[3]。LMP1 基因是公認(rèn)的EBV惡性轉(zhuǎn)化基因，HU等[4]和CHEN等[5]在研究鼻咽癌時(shí)發(fā)現(xiàn)存在30 bp堿基缺失的LMP1基因，且缺失型LMP1與無(wú)30 bp堿基缺失的野生型比較具有更強(qiáng)的致瘤性和細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力。有關(guān)鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤等腫瘤以及良性淋巴組織增生疾病中LMP1缺失型基因的情況已有報(bào)道，但結(jié)果不一[4-6]。本研究旨在檢測(cè)ENKTCL中EBV的感染情況，探討EBV陽(yáng)性ENKTCL組織中病毒基因型以及LMP1編碼基因的變異情況，為進(jìn)一步研究EBV感染與ENKTCL的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

ENKTCL組織標(biāo)本75例取自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2008年6月—2013年6月病理確診病例，其中男45例，女30例；病人年齡13～77歲，中位年齡50歲。發(fā)病部位主要為鼻腔、鼻咽等上呼吸道。實(shí)驗(yàn)所用EBV陽(yáng)性細(xì)胞系B95-8、Raji和EBV陰性Ramos細(xì)胞購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心，EBV陽(yáng)性細(xì)胞系P3HR-1由日本鳥(niǎo)取大學(xué)醫(yī)學(xué)部生體情報(bào)學(xué)教室西連寺剛教授惠贈(zèng)。

1.2 原位雜交篩選EBV陽(yáng)性標(biāo)本

按參考文獻(xiàn)方法[7]設(shè)計(jì)EBER1特異性寡核苷酸探針，Dig Oligonucleotide 3′-end Labeling Kit標(biāo)記探針購(gòu)自Roche公司。石蠟包埋組織切片二甲苯脫蠟后乙醇梯度水化，用40 g/L甲醛溶液固定，蛋白酶K(100 mg/L)37 ℃消化15 min后，以1 g/L甘氨酸溶液輕洗30 s終止消化反應(yīng)，加地高辛標(biāo)記的EBER1寡核苷酸探針37 ℃雜交反應(yīng)過(guò)夜。次日Blocking Buffer封片后加堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，37 ℃反應(yīng)1 h，最后加顯色液(NBT/BCIP)置濕盒中37 ℃反應(yīng)3 h，并用5 g/L甲基綠復(fù)染5～20 min。光鏡下觀察結(jié)果，細(xì)胞核濃染呈深紫色者為EBER1陽(yáng)性。同步應(yīng)用sense探針進(jìn)行雜交反應(yīng)特異性的檢測(cè)。

1.3 石蠟包埋腫瘤組織DNA提取

因腫瘤較小，部分病例不能取得足夠組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本研究切取56例原位雜交陽(yáng)性ENKTCL石蠟包埋組織各5～8片，每片厚度約4 μm，采用德國(guó)QIAGEN公司QIAAmp FFPE DNA提取試劑盒提取DNA進(jìn)行分型研究，操作嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行。

1.4 EBV 1/2分型、F/f分型及C/D分型檢測(cè)

依據(jù)基因缺失序列情況，參考文獻(xiàn)方法[8-9]設(shè)計(jì)引物，采用PCR技術(shù)檢測(cè)感染EBV的1/2分型，以PCR結(jié)合限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析技術(shù)檢測(cè)F/f分型以及C/D分型。

1.4.1PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括DNA 模板3 μL，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U，10×Buffer 2.5 μL，MgCl21.5 mmol/L，上下游引物各0.4 μmol/L。循環(huán)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于含0.5 mg/L溴化乙錠的20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)置：細(xì)胞系B95-8作1型和F型對(duì)照；細(xì)胞系P3HR1為2型對(duì)照；細(xì)胞系Raji作為D型對(duì)照；本實(shí)驗(yàn)室已成功鑒定的1例f型ENKTCL標(biāo)本為f型陽(yáng)性對(duì)照。每次PCR反應(yīng)均用無(wú)酶雙蒸水作陰性對(duì)照。

1.4.2RFLP分析 采用德國(guó)QIAGEN公司凝膠DNA回收試劑盒對(duì)F/f分型、C/D分型的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，用BamH Ⅰ限制性?xún)?nèi)切酶消化。酶切體系15 μL，包括DNA 8 μL，10×K Buffer 1.5 μL，15×106U/L BamH Ⅰ 1 μL，無(wú)酶雙蒸水4.5 μL，充分混勻后瞬時(shí)離心，30 ℃水浴4 h。取酶切產(chǎn)物5 μL于含0.5 mg/L溴化乙錠的20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。細(xì)胞系B95-8的EBV BamH Ⅰ F片段無(wú)BamH Ⅰ識(shí)別位點(diǎn)即為F型(酶切產(chǎn)物電泳條帶仍為198 bp)；f型對(duì)照標(biāo)本在該區(qū)域出現(xiàn)BamH Ⅰ位點(diǎn)(PCR產(chǎn)物酶切后出現(xiàn)長(zhǎng)127 bp和71 bp兩條帶)。細(xì)胞系Raji的 EBV BamH Ⅰ W1/I1交界區(qū)保留BamH Ⅰ識(shí)別位點(diǎn)為D型(PCR產(chǎn)物酶切后出現(xiàn)長(zhǎng)130 bp和76 bp兩條帶)，酶切后仍呈單一條帶(206 bp)者為C型。

1.4.3基因序列分析 選取經(jīng)酶切鑒定的F/f分型和C/D分型的4種EBV型別的部分標(biāo)本，采用末端終止法、由北京華大基因有限公司對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序引物為PCR擴(kuò)增引物。應(yīng)用Primer premier 5軟件檢查序列有無(wú)BamH Ⅰ識(shí)別位點(diǎn)，對(duì)PCR-RFLP結(jié)果進(jìn)行鑒定。

1.5 LMP1基因C端序列分析

參照文獻(xiàn)的方法[10]設(shè)計(jì)檢測(cè)LMP1基因C端30 bp缺失的特異性引物，采用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件同上。同時(shí)選取部分標(biāo)本的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序以驗(yàn)證結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 原位雜交

EBER1陽(yáng)性信號(hào)位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，核濃染呈深紫色；毗鄰切片的同一組織蘇木精-伊紅染色顯示EBER1陽(yáng)性信號(hào)均來(lái)源于腫瘤細(xì)胞。EBV陽(yáng)性ENKCTL標(biāo)本的組織切片用EBER1 sense探針雜交細(xì)胞核呈淺綠色，未出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，證實(shí)了反應(yīng)的特異性。本文75例ENKCTL標(biāo)本中，共有67例EBER1陽(yáng)性，陽(yáng)性率為89.3%；發(fā)生在鼻腔部位的66例標(biāo)本中有63例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為95.0%。

2.2 EBV 1/2分型、F/f及C/D分型

1型EBV擴(kuò)增條帶長(zhǎng)為498 bp，2型EBV長(zhǎng)為150 bp；C型EBV限制性核酸內(nèi)切酶BamH Ⅰ酶切PCR產(chǎn)物后條帶長(zhǎng)為206 bp，D型EBV酶切后表現(xiàn)為長(zhǎng)130 bp和76 bp兩條帶；F型EBV限制性核酸內(nèi)切酶BamH Ⅰ酶切PCR產(chǎn)物后條帶仍為長(zhǎng)198 bp，f型EBV酶切后表現(xiàn)為長(zhǎng)127 bp和71 bp兩條帶。見(jiàn)圖1。56例進(jìn)行分型檢測(cè)的EBV陽(yáng)性ENKTCL標(biāo)本中，1型EBV 45例(80.4%)，2型EBV 11例(19.6%)；F型EBV 49例(87.5%)，f型EBV 7例(12.5%)；C型EBV 37例(66.1%)，D型EBV 19例(33.9%)。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果證實(shí)F型EBV無(wú)BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)，而由于突變f型EBV增加了BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)；C型EBV無(wú)BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)，D型EBV則保留了BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)。

2.3 LMP1檢測(cè)

本文對(duì)48例EBV陽(yáng)性ENKTCL標(biāo)本LMP1的C端序列進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果表明，野生型8例(16.7%)，缺失型40例(83.3%)。部分標(biāo)本LMP1基因C端PCR產(chǎn)物電泳圖見(jiàn)圖2，161 bp者為野生型LMP1變異，131 bp者為缺失型LMP1變異。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果可靠。

M:DNA Marker DL2000；④、⑦、、、、分別為1型、2型、F型、f型、C型、D型陽(yáng)性對(duì)照；⑧、、為陰性對(duì)照；①～③為1型EBV標(biāo)本；⑤、⑥為2型EBV標(biāo)本,⑨～為F型EBV標(biāo)本；、為f型EBV標(biāo)本；～為C型EBV標(biāo)本；為D型EBV標(biāo)本。

圖1部分EBV陽(yáng)性標(biāo)本基因分型電泳結(jié)果

M:DNA Marker DL2000；①～④為L(zhǎng)MP1野生型標(biāo)本；⑤～⑦為L(zhǎng)MP1缺失型標(biāo)本；⑧為陰性對(duì)照。

3 討 論

ENKTCL在我國(guó)是一種較為常見(jiàn)的非霍奇金淋巴瘤，具有獨(dú)特的臨床病理特點(diǎn)，男性病人多于女性，年齡以40～50歲居多，好發(fā)于鼻腔[3]。EBV屬于皰疹病毒科γ亞科DNA腫瘤病毒，90%以上的健康成人攜帶該病毒，雖然大部分EBV感染者一直處于隱性感染狀態(tài)，但EBV感染可促使相關(guān)腫瘤的

產(chǎn)生。EBV感染與人類(lèi)多種淋巴細(xì)胞和上皮性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，例如鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤等，早在1997年的世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)的報(bào)告中，已經(jīng)將EBV歸類(lèi)為致癌病毒[11-13]。在本研究中EBER1 原位雜交陽(yáng)性率高達(dá)89.3%(56/75)，提示EBV感染與ENKTCL的發(fā)生密切相關(guān)，尤其是發(fā)生在鼻腔部位的病例，EBV感染率高達(dá)95.0%，而鼻外器官EBV感染率則相對(duì)較低，說(shuō)明EBV感染有部位依賴(lài)性，可能是在鼻咽及口腔部位病理?yè)p傷的基礎(chǔ)上，EBV于鼻咽部和口腔腺體上皮細(xì)胞中的長(zhǎng)期潛伏誘發(fā)了ENKTCL[3]。

ENKTCL好發(fā)于亞洲及拉丁美洲等地區(qū)，這與EBV慢性感染者的地理分布相吻合，而且不同地區(qū)人群感染的EBV基因類(lèi)型也不相同[3,14-15]。目前，對(duì)ENKTCL中EBV基因型別的研究多集中于1/2分型，而對(duì)F/f變異和C/D變異的研究較少[3]。本研究顯示，本地區(qū)EBV感染以1型為主，與先前亞洲地區(qū)的報(bào)道結(jié)果相符[16-17]。有研究顯示，1型與2型EBV的生物學(xué)功能存在差異，1型EBV的B細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能更強(qiáng)。本文結(jié)果提示，本地區(qū)ENKTCL的發(fā)生與細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能更強(qiáng)的1型EBV感染密切相關(guān)。而有關(guān)研究顯示，在秘魯及巴西ENKTCL病人中2型EBV感染占主導(dǎo)地位[3,14]。由此進(jìn)一步說(shuō)明不同EBV基因型在不同地區(qū)的分布不同。

本文結(jié)果顯示，本地區(qū)ENKTCL病人EBV以F(87.5%)及C(66.1%)型變異較為多見(jiàn)，與本地區(qū)鼻咽癌組織中EBV的基因類(lèi)型相符[18]。SIDAGIS等[19]報(bào)道，日本EBV相關(guān)T/NK淋巴細(xì)胞瘤組織中C型和F型變異率較高，分別為72.7% (8/11)和100% (11/11)，且F型和C型EBV也是EBV相關(guān)胃癌和鼻咽癌的主要毒株；而在歐洲和北美地區(qū)鼻咽癌組織中則以D型及f型EBV毒株為主[20]。由此可見(jiàn)，不同地區(qū)感染EBV基因類(lèi)型有所不同，本地區(qū)EBV陽(yáng)性ENKTCL組織中感染的EBV以1型、F型和C型為主，而不同類(lèi)型EBV基因變異對(duì)ENKTCL發(fā)生發(fā)展的影響有待進(jìn)一步研究。

作為公認(rèn)的EBV轉(zhuǎn)化基因和致癌基因，LMP1能誘導(dǎo)Bcl-2 基因產(chǎn)物表達(dá)，阻止細(xì)胞凋亡，從而使EBV感染細(xì)胞永生化，還可在體外轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物纖維母細(xì)胞和人角質(zhì)細(xì)胞，抑制人上皮細(xì)胞的分化和凋亡，誘導(dǎo)表皮生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，且在大多數(shù)EBV相關(guān)腫瘤組織中表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生中具有重要作用[21]。而且有關(guān)鼻咽癌的研究結(jié)果顯示，LMP1缺失型與野生型比較致瘤性和細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力更強(qiáng)[4-5]。在國(guó)內(nèi)尚未有ENKTCL組織中LMP1缺失型與野生型的詳盡報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，在ENKTCL中感染的EBV以L(fǎng)MP1缺失型為主，提示LMP1編碼基因C端30 bp堿基的缺失可能與ENTKCL的發(fā)生有一定相關(guān)性。有研究認(rèn)為，這種缺失型的致瘤性和細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力明顯增強(qiáng)，且免疫原性減弱，可能是因?yàn)長(zhǎng)MP1基因的30 bp堿基缺失處正位于NF-κB 的上游，在形成淋巴瘤后缺失型LMP1被激活, 促使NF-κB異?；罨? 從而產(chǎn)生抗凋亡性; 也可能是由于部分遺傳結(jié)構(gòu)的丟失減弱了LMP1蛋白的免疫原性, 使之較易逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視, 最終延長(zhǎng)并增強(qiáng)了LMP1的致瘤作用[6]。LMP1缺失型在ENKTCL發(fā)生中的致瘤作用尚未明確，本研究擬進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量, 在蛋白水平上直接檢測(cè)LMP1野生型和缺失型基因的表達(dá)情況, 深入探討LMP1野生型和缺失型在ENKTCL發(fā)生中的意義。

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