谷蘊(yùn)婷 于霞 李云絮 趙立平 王桂榮 陳素婷 黃海榮

結(jié)核病是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，結(jié)核病疫情不但在發(fā)展中國(guó)家繼續(xù)惡化,在許多發(fā)達(dá)國(guó)家也呈現(xiàn)回升趨勢(shì)。目前全球已有20億人感染結(jié)核分枝桿菌，而活動(dòng)性結(jié)核病患者達(dá)1500萬(wàn)例，每年新增結(jié)核病患者約800～1000萬(wàn)例，每年有180萬(wàn)例因結(jié)核病死亡[1]。耐多藥(multidrug-resistant, MDR)結(jié)核病和廣泛耐多藥(extensively drug-resistant, XDR)結(jié)核病的出現(xiàn)對(duì)藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)“藥敏試驗(yàn)”)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性提出了更高的要求[2-4]。INH是一種重要的一線抗結(jié)核藥物，也是診斷MDR的藥物之一，因此準(zhǔn)確認(rèn)定是否INH耐藥對(duì)于患者的臨床轉(zhuǎn)歸非常重要。

以羅氏(L-J)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的藥敏試驗(yàn)是一個(gè)在全世界范圍內(nèi)廣泛使用的方法，尤其是在發(fā)展中國(guó)家。羅氏培養(yǎng)基常用的方法包括絕對(duì)濃度法和比例法，這兩種方法的報(bào)告時(shí)間分別為4周和6周。國(guó)內(nèi)臨床機(jī)構(gòu)多采用絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)，在日常的絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)臨床檢驗(yàn)工作中，個(gè)別菌株在含INH培養(yǎng)基上4周時(shí)無(wú)菌落生長(zhǎng)而延長(zhǎng)至6周后又有菌落生長(zhǎng)。為了明確上述菌落形成的原因及其耐藥性，本研究收集符合上述情況的菌株做進(jìn)一步研究。

材料和方法

一、材料和試劑來(lái)源

1.菌株來(lái)源：首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院國(guó)家結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室于2010年1—6月進(jìn)行絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)的菌株為546株，在37 ℃培養(yǎng)4周后，244株菌株對(duì)INH耐藥[低度耐藥和高度耐藥臨界值分別為0.2 μg/ml 和 1 μg/ml。收集絕對(duì)濃度法37 ℃含INH的L-J培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周時(shí)無(wú)菌落生長(zhǎng)、時(shí)間延長(zhǎng)至6周后生長(zhǎng)的13株菌株(含藥培養(yǎng)基延遲生長(zhǎng)菌株)，其中4株在INH濃度為1 μg/ml的培養(yǎng)基上有延遲生長(zhǎng)，7株在在INH濃度為0.2 μg/ml的培養(yǎng)基上有延遲生長(zhǎng)，2株在上述2個(gè)INH濃度的培養(yǎng)基上都有生長(zhǎng)。這些菌株來(lái)源于11例結(jié)核病患者(2例患者的菌株在低濃度和高濃度INH培養(yǎng)基上均有菌落生長(zhǎng))；同時(shí)收集這11例結(jié)核病患者的臨床敏感株作為對(duì)照菌株。共計(jì)24株菌株，此24株菌株均經(jīng)過(guò)16S RNA和16S～23S間區(qū)序列測(cè)序后確定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審查通過(guò)，所有患者均已簽署知情同意書(shū)。

2.試劑和儀器：標(biāo)準(zhǔn)株H37RV來(lái)源于北京胸科醫(yī)院參比實(shí)驗(yàn)室。2×PCR Taq MasterMix購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；所用引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；尼龍膜(Biodyne C)購(gòu)自美國(guó)Pall Biosupport 公司；抗生蛋白鏈菌素-過(guò)氧化物酶結(jié)合物(streptavidin-peroxidase conjugate)和CDP-Star檢測(cè)試劑購(gòu)自美國(guó)GE公司。

二、方法

1．菌種鑒定：將含INH培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的13株菌株和普通羅氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的11株臨床敏感菌株傳代，在37 ℃培養(yǎng)3周，至有菌落生長(zhǎng)。對(duì)傳代培養(yǎng)的菌株進(jìn)行水煮法粗提DNA，然后PCR擴(kuò)增其16S RNA和16S～23S間區(qū)序列進(jìn)行菌種鑒定[5-7]。引物序列和擴(kuò)增條件見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]。16S RNA 產(chǎn)物約800 bp, 16S～23S間區(qū)序列約400～600 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。對(duì)比美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI) BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)在線數(shù)據(jù)庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)株確定其菌種。

2．菌株分型和突變分析：(1)間隔區(qū)寡核苷酸分型(spacer oligo-nucleotide typing, spoligotyping)檢測(cè)：利用spoligotyping進(jìn)行菌株的基因分型，操作方法如文獻(xiàn)[9-10]所述。(2)分枝桿菌散在分布重復(fù)單位(Mycobacterium interspersed repetitive unit，MIRU)分型法：采用Cowan等[11]的方法，選擇12位點(diǎn)，進(jìn)行測(cè)定分析。(3)耐藥基因突變測(cè)定：PCR擴(kuò)增與異煙肼耐藥相關(guān)的基因片段katG和inhA，后進(jìn)行測(cè)序分析，具體操作參考文獻(xiàn)[12]。

3．比例法藥敏試驗(yàn)：對(duì)收集的24株菌株均進(jìn)行比例法藥敏試驗(yàn)，以確定其對(duì)INH的敏感性，INH藥物濃度為0.2 μg/ml,具體操作參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[13]進(jìn)行。

4．不同比例混合菌株在不同報(bào)告時(shí)間的絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)：為了探討混合感染對(duì)藥敏試驗(yàn)的影響，進(jìn)行人工模擬不同比例INH敏感菌株和耐藥菌株的混合，觀察不同報(bào)告時(shí)間(4周和6周)，藥敏試驗(yàn)結(jié)果是否出現(xiàn)差異。選擇對(duì)照菌株和含藥培養(yǎng)基延遲生長(zhǎng)菌株MRIU分型不同的3例菌株(7019H0.2,7285H0.2和7325H1)，分別與H37Rv按照以下比例混合：100∶0；1∶2；1∶4；1∶8；1∶16；1∶32；1∶64；1∶128；1∶256；0∶100。藥敏試驗(yàn)采用絕對(duì)濃度法，INH濃度分別為1 μg/ml、0.2 μg/ml。具體操作參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[13]進(jìn)行。

5.質(zhì)量控制(簡(jiǎn)稱(chēng)“質(zhì)控”)：質(zhì)控均以標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和陰性對(duì)照進(jìn)行。對(duì)于不合理的質(zhì)控結(jié)果，采取重新檢測(cè)質(zhì)控樣品再次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

三、資料收集及數(shù)據(jù)處理

電話隨訪所納入的11例患者在首次就診后的2年內(nèi)是否再次入院，以及再次就診時(shí)絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)中對(duì)INH的耐藥情況。涉及的數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

結(jié) 果

1.菌株分型和耐藥基因突變情況:間隔區(qū)寡核苷酸分型顯示僅有3株表現(xiàn)為非北京基因型，其余21株均為北京基因型。MIRU分型顯示11例患者中有5例患者的對(duì)照菌株和分型不同。13株含藥培養(yǎng)基延遲生長(zhǎng)菌株中10株存在S315T突變。編號(hào)9,10,11的患者對(duì)照菌株和含藥培養(yǎng)基延遲生長(zhǎng)菌株spoligotying分型不一致。具體基因分型和耐藥突變情況(表1)。

2.比例法藥敏試驗(yàn): 比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示13株含藥培養(yǎng)基延遲生長(zhǎng)菌株均為INH耐藥，而11株對(duì)照菌株均為INH敏感。

3.混合菌株在不同報(bào)告時(shí)間的絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)結(jié)果: 當(dāng)H37Rv與7325H1按不同比例混合后，比例為1∶128和1∶256的混合菌株在4周后在培養(yǎng)基上沒(méi)有菌落生長(zhǎng)；而6周菌落數(shù)低濃度INH培養(yǎng)基的菌落數(shù)分別為29和12；高濃度INH的菌落數(shù)分別為6和3。H37Rv與7019H0.2按不同比例混合后，比例為1∶64、1∶128和1∶256的混合菌株在4周后低濃度INH培養(yǎng)基的菌落數(shù)分別為15、10和3；6周后的菌落數(shù)分別為50、20和11(表2)。

表1 納入的11例患者的分型和耐藥突變結(jié)果

4.隨訪結(jié)果:11例患者中有3例在本次就診后2年內(nèi)再次入院，均為菌陽(yáng)患者且絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)均顯示對(duì)INH耐藥。具體患者信息和隨訪信息見(jiàn)表3。

表2 人工混合感染模型4周和6周的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表3 納入的11例患者的基本信息和隨訪信息

討 論

中國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家，全國(guó)結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報(bào)告顯示，初治患者和復(fù)治患者INH的耐藥率分別為16%和38.5%[14]。本研究樣本收集期間，收集菌株中對(duì)INH的耐藥率已經(jīng)達(dá)到44.7% (244/546)。本研究納入的11例患者中,有3例患者在本次就診后2年內(nèi)再次入院的藥敏試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)為對(duì)INH耐藥, 且這3例患者均使用INH進(jìn)行抗結(jié)核治療。本研究結(jié)果同時(shí)表明，13株含藥培養(yǎng)基延遲生長(zhǎng)菌株通過(guò)比例法藥敏試驗(yàn)均證實(shí)為對(duì)INH耐藥的菌株。提示在國(guó)內(nèi)結(jié)核病高耐藥的背景下，應(yīng)該高度警惕對(duì)INH耐藥的假陰性現(xiàn)象。

盡管絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)包括對(duì)硝基苯甲酸(PNB)鑒定，但有部分非結(jié)核分枝桿菌會(huì)對(duì)500 μg/ml 的PNB敏感[15]。本研究為了排除非結(jié)核分枝桿菌的影響，利用PCR對(duì)菌株做了菌種鑒定，并利用spoligotyping技術(shù)對(duì)24株待測(cè)菌株做了基因分型。結(jié)果顯示，11株來(lái)自普通羅氏培養(yǎng)基生長(zhǎng)的對(duì)照株和13株含藥培養(yǎng)基延遲生長(zhǎng)菌株均為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，其中僅有3株表現(xiàn)為非北京基因型，其余21株均為北京基因型。

有研究顯示，平均17%高發(fā)病率地區(qū)的新發(fā)結(jié)核病患者均為多重感染[16]。Shen 等[17]研究表明，在上海52例復(fù)發(fā)的結(jié)核病患者中，32例(32/52，61.5%)患者第一次和第二次感染的菌株屬于不同的型別。這個(gè)結(jié)果表明，外原性再感染在高發(fā)病國(guó)家很常見(jiàn)。本研究spoligotying 分型結(jié)果表明，11例患者中3例患者對(duì)照株和含藥培養(yǎng)基延遲生長(zhǎng)菌株擁有不同的型別，其中2例患者的含藥培養(yǎng)基延遲生長(zhǎng)菌株屬于北京基因型而對(duì)照培養(yǎng)基為其他分型，另外1株正好相反；MIRU分型結(jié)果提示，11例患者中5例患者中的對(duì)照株和含藥培養(yǎng)基延遲生長(zhǎng)菌株擁有不同的型別，提示這5例患者同時(shí)感染了對(duì)INH耐藥和敏感的2種菌株，既患者的一份痰標(biāo)本中包含著2種不同比例的對(duì)INH耐藥和敏感的菌株。選擇3株對(duì)照株和含藥培養(yǎng)基延遲生長(zhǎng)菌株MIRU分型不同的菌株，與結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv按照不同比例混合后，觀察不同報(bào)告時(shí)間的藥敏試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果證實(shí)，當(dāng)耐藥菌株的比例較低，如耐藥與敏感菌株的比例小于1∶128時(shí)，就可能會(huì)出現(xiàn)含INH培養(yǎng)基4周時(shí)無(wú)菌落生長(zhǎng)而6周后有菌落生長(zhǎng)的情況。

細(xì)菌在長(zhǎng)期的藥物作用下會(huì)出現(xiàn)耐藥突變[18]。因此，本研究中的含藥培養(yǎng)基延遲生長(zhǎng)菌株的生長(zhǎng)延遲現(xiàn)象可能由體外耐藥突變引起。Viveiros等[18]研究表明，經(jīng)體外誘導(dǎo)對(duì)INH高度耐藥的菌株并不存在katG基因S315T突變。該研究選擇H37Rv和8株對(duì)INH敏感的臨床分離株，通過(guò)在剛剛低于最低抑菌濃度(MIC)的藥物濃度中培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)6代后，這些菌株對(duì)INH的MIC值均>20 μg/ml。而本研究中，10株(10/13, 76.92%)菌株存在S315T突變，僅將報(bào)告時(shí)間延長(zhǎng)2周似乎不足以誘導(dǎo)細(xì)菌在體外發(fā)生S315T突變，因此可以推斷本研究中部分伴有S315T突變的含藥培養(yǎng)基延遲生長(zhǎng)菌株可能源于體內(nèi),但是也不能排除外來(lái)感染的可能性。

本研究?jī)H選擇INH作為代表藥物來(lái)解釋對(duì)于敏感菌株延長(zhǎng)藥敏試驗(yàn)時(shí)間的必要性。由于這樣的菌株數(shù)量很少，所以很難獲得一個(gè)大量的樣本。本研究的目的是解釋一個(gè)現(xiàn)象，因此樣本的數(shù)量可能足夠。

綜上所述，INH作為主要的抗結(jié)核藥物之一，其藥敏試驗(yàn)的準(zhǔn)確性對(duì)于治療至關(guān)重要。對(duì)于同一患者的藥敏試驗(yàn)結(jié)果的不一致，尤其是前一份結(jié)果耐藥，后一份結(jié)果敏感的情況，應(yīng)該警惕耐藥結(jié)果的假陰性。本研究中，大約2% (11/546) 的患者在延長(zhǎng)藥敏試驗(yàn)報(bào)告時(shí)間后菌株對(duì)INH由敏感變成耐藥。如果延長(zhǎng)2周的孵育時(shí)間，會(huì)導(dǎo)致這部分患者的治療方案發(fā)生變化。

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