陳炳輝,王智美,顏 麗,王夢(mèng)媛 ,李 文

(1．中山大學(xué)地球科學(xué)與地質(zhì)工程學(xué)院，廣東 廣州 510275；2. 廣東省地質(zhì)過程與礦產(chǎn)資源探查重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510275；3. 廣東藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510310)

硫化物礦物的微生物氧化作用研究被廣泛地應(yīng)用于濕法冶金領(lǐng)域，認(rèn)為在氧化亞鐵硫桿菌(A.f.)的作用下，硫化物礦物的氧化速度會(huì)加快。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始重視酸性礦山環(huán)境中A.f.對(duì)黃鐵礦、磁黃鐵礦、黃銅礦、毒砂等硫化物礦物的生物氧化作用的研究[1-9]，發(fā)現(xiàn)在pH<4的酸性環(huán)境中，硫化物礦物以生物化學(xué)氧化過程為主，而且鐵離子會(huì)加速硫化物礦物的氧化[1-4]。

毒砂(FeAsS)是金屬硫化物礦床及尾礦中常見的含砷硫化物礦物，毒砂氧化后釋放的砷進(jìn)入水環(huán)境會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的生態(tài)污染，引起國(guó)內(nèi)學(xué)者的關(guān)注。郁云妹等研究了毒砂的化學(xué)氧化作用與水溶液pH的關(guān)系,獲得毒砂氧化釋放的溶解As質(zhì)量濃度隨溶液pH升高呈V字形變化,pH值在7～8之間最低[8]；張珊珊等通過生物氧化和化學(xué)氧化的對(duì)比試驗(yàn)，探討氧化亞鐵硫桿菌與毒砂相互作用的階段性和氧化機(jī)制[9]；朱婷婷等實(shí)驗(yàn)研究了毒砂微生物氧化作用形成的次生礦物類型，指出毒砂在A.f.作用下的次生礦物主要為鐵的硫酸鹽、砷酸鹽和亞砷酸鹽；分析了微生物作用前后毒砂表面Fe、As和S三種元素的價(jià)態(tài)變化，探討了毒砂表面次生礦物成因和As的化學(xué)態(tài)變化[10]。但不同環(huán)境(如pH、Fe2+含量等)對(duì)毒砂生物氧化作用的影響還不清楚。

本文利用從大寶山多金屬礦酸性礦山廢水中培養(yǎng)得到的A.f.菌，研究不同初始pH和Fe離子含量對(duì)毒砂微生物氧化作用的影響，這不僅有助于深入了解毒砂的微生物氧化機(jī)理，而且對(duì)富砷酸性礦山廢水的環(huán)境治理等方面有參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 9K培養(yǎng)基的配置

準(zhǔn)確稱取(NH4)2SO43.00 g，KCl 0.10 g，K2HPO40.10 g ，MgSO4·7H2O 0.50 g, Ca(NO3)20.01 g，雙蒸水600.0 mL，用1∶1 H2SO4調(diào)pH為2.00，在121 ℃滅菌15 min, 配制不含F(xiàn)e的9K培養(yǎng)基。

另稱取FeSO4·7H2O 44.30 g溶于400.0 mL雙蒸水,用同樣的方法將pH調(diào)為2.00，用孔徑為0.22 μm過濾器過濾除菌，然后將其與上述不含F(xiàn)eSO4·7H2O的9K培養(yǎng)基混合，配制含F(xiàn)e的9K培養(yǎng)基。

1.2 氧化亞鐵硫桿菌菌懸液

從大寶山尾礦庫酸性礦山廢水培養(yǎng)得到的A.f.菌株培養(yǎng)液[11]，進(jìn)行加富培養(yǎng)，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)用A.f.的菌懸液的密度達(dá)到1×107個(gè)/mL。

1.3 礦物粉末的制備

將毒砂礦樣敲碎后，在立體顯微鏡下除去多余雜物后，粉碎到直徑小于0.18 mm(過80目篩)，用無水乙醇浸泡30 min后，再用去離子水清洗3遍，放置于真空干燥箱，設(shè)定溫度為50 ℃，2 h后取出并封存。

1.4 實(shí)驗(yàn)過程

所有浸泡實(shí)驗(yàn)均在潔凈工作臺(tái)(潔凈等級(jí)100級(jí))完成。浸泡實(shí)驗(yàn)在250 mL的錐形瓶中進(jìn)行，礦漿質(zhì)量濃度為3 g/mL(100 mL溶液中含3 g毒砂粉末)。將毒砂粉末加入到含有Fe2+和不含F(xiàn)e2+的9K培養(yǎng)基中，接種10%(加入的菌懸液/溶液總體積)的A.f液懸液，用1∶1的H2SO4調(diào)節(jié)pH，分別為2.00、3.00和3.50，將錐形瓶放置于振蕩器(HZQ-C空氣浴振蕩器)，培養(yǎng)溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min，每日振蕩20 h。同時(shí)進(jìn)行無菌浸泡的對(duì)比實(shí)驗(yàn)。定期測(cè)定溶液中As離子、Fe2+質(zhì)量濃度和pH值。

文中樣品代號(hào)的含義：Y-2、Y-3、Y-3.5分別表示初始pH2.00、pH3.00和pH3.50，均為不含F(xiàn)e2+的9K培養(yǎng)基，接種A.f.浸泡；FeWY-2、FeWY-3、FeWY-3.5分別表示初始pH2.00、pH3.00和pH3.50，均為含F(xiàn)e2+的9K培養(yǎng)基,無菌浸泡；FeY-2、FeY-3、FeY-3.5分別表示初始pH2.00、pH3.00和pH3.50，均為含F(xiàn)e2+的9K培養(yǎng)基, 接種A.f.浸泡。

1.5 分析測(cè)試方法

實(shí)驗(yàn)溶液中的陽離子利用IRIS(HR)等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP-AES)分析，pH值利用PHS-25型精密pH計(jì)測(cè)定。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 浸泡實(shí)驗(yàn)過程溶液變化

在含鐵9K培養(yǎng)基有菌氧化實(shí)驗(yàn)中，初始pH2.00的溶液，前23 d顏色變化不大，后7 d顏色變化較為明顯，至第30天反應(yīng)結(jié)束，溶液變?yōu)樯罹G色；初始pH3.00的溶液，前23天變化微弱，較初始pH2.00溶液顏色稍深，至第30天結(jié)束，溶液變?yōu)辄S綠色；初始pH3.50的溶液變化較為明顯，第2天即已變?yōu)橥咙S色，第6天時(shí)為黃褐色且有褐色沉淀生成，至反應(yīng)結(jié)束溶液已變?yōu)辄S色，大量沉淀附著于瓶壁和瓶底。

在含鐵9K培養(yǎng)基無菌氧化實(shí)驗(yàn)中，初始pH2.00的溶液，與加入菌體同等pH條件下顏色變化類似，前23 d溶液顏色除稍變渾濁外，無其他明顯變化，至第30天反應(yīng)結(jié)束，溶液變?yōu)樯罹G色；初始pH3.00的溶液，前23 d變化非常微弱，可見其逐漸變渾濁的過程，后7 d變化明顯，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，變?yōu)辄S綠色，比加入菌體溶液顏色稍淺，偏渾濁；初始pH3.50的溶液變化比較特殊，瓶壁未見沉淀。

在無鐵9K培養(yǎng)基有菌氧化的實(shí)驗(yàn)溶液,顏色變化不如含鐵9K培養(yǎng)基溶液明顯。初始pH2.00的溶液顏色變化比初始pH3.00的溶液變化明顯，前23 d變化較為微弱，稍渾濁，至第30天，前者顏色為深綠色，色澤鮮艷，后者顏色明顯稍淺，混雜灰色；而初始pH3.50的溶液，前23 d溶液顏色時(shí)候未見變化，第23天開始稍顯渾濁，至第30天溶液完全變?yōu)樯罹G色，且瓶壁有大量沉淀附著。

2.2 浸泡實(shí)驗(yàn)過程溶液陽離子質(zhì)量濃度

浸泡實(shí)驗(yàn)過程溶液中As離子和Fe2+離子質(zhì)量濃度變化如表1所示。

2.3 浸泡實(shí)驗(yàn)過程溶液pH變化

浸泡實(shí)驗(yàn)過程溶液pH變化如表2所示。

3 討 論

3.1 不同初始pH值對(duì)毒砂生物氧化溶液As離子質(zhì)量濃度的影響

為了排除Fe2+對(duì)毒砂生物氧化作用的影響，利用不同初始pH值含菌不含鐵培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)溶液As離子質(zhì)量濃度變化來討論不同初始pH值對(duì)毒砂生物氧化的影響。從圖1可以看出，反應(yīng)前11d，各溶液中As離子質(zhì)量濃度變化規(guī)律較好，呈上升趨勢(shì)，且初始pH2.00的溶液中As離子的溶出速率較快，初始pH3.00和3.50的溶液As離子質(zhì)量濃度變化較慢，到第11天，初始pH2.00、3.00和3.50的實(shí)驗(yàn)溶液中As離子質(zhì)量濃度分別為616.5, 80.0和48.6 mg/L(表1)，說明反應(yīng)開始pH越低，毒砂生物氧化速度越快。

表1 實(shí)驗(yàn)溶液中As離子和Fe2+質(zhì)量濃度1)

1) 分析單位：中山大學(xué)測(cè)試中心；第1、3、7天測(cè)試時(shí)稀釋5倍，其它測(cè)試時(shí)稀釋50倍；最低檢測(cè)限: As為0.05 mg/L

從第11-23天，各溶液中As離子質(zhì)量濃度變化趨勢(shì)比較復(fù)雜，這可能與反應(yīng)一段時(shí)間后毒砂氧化釋放出的Fe2+以及溶液變化過程見到的次生礦物的沉淀有關(guān)。但到反應(yīng)第30天，初始pH2.00、3.00和3.50的實(shí)驗(yàn)溶液中As離子質(zhì)量濃度分別為847.5, 239.0和57.0 mg/L，三者比例大約為15∶4∶1。即反應(yīng)30 d后初始pH2.00比初始pH3.50的溶液中As離子質(zhì)量濃度要高大約15倍。

表2 浸泡實(shí)驗(yàn)過程溶液pH值

圖1 不同初始pH值含菌不含鐵培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)溶液As離子質(zhì)量濃度變化

3.2 Fe2+對(duì)毒砂生物氧化作用的影響

圖2分別對(duì)比了初始pH2.00、3.00和3.50的不含鐵和含鐵培養(yǎng)基的含菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以明顯看出，相同初始pH的含鐵培養(yǎng)基比不含鐵培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)溶液As離子質(zhì)量濃度要高得多，實(shí)驗(yàn)30 d后，初始pH2.00, 3.00和3.50的含鐵培養(yǎng)基溶液中As離子質(zhì)量濃度(分別為1 564.5, 1 419.0和2 550.5 mg/L)比不含鐵培養(yǎng)基溶液中As離子質(zhì)量濃度(分別為847.5, 239.0和57.0 mg/L)分別高出約2、6和45倍。

參照實(shí)驗(yàn)結(jié)果中實(shí)驗(yàn)過程溶液變化情況，含鐵培養(yǎng)基比不含鐵培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)系列中溶液顏色變化和沉淀情況要復(fù)雜，溶液中As離子質(zhì)量濃度變化未必真正反映毒砂的氧化速率，但結(jié)果還是可以說明Fe2+對(duì)毒砂生物氧化有明顯的促進(jìn)作用。

3.3 Fe2+對(duì)毒砂氧化作用過程溶液pH的影響

從表2可以看出有鐵培養(yǎng)基無菌(FeWY2、FeWY3、FeWY3.5)和有鐵培養(yǎng)基有菌(FeY2、FeY3、FeY3.5)相同初始pH的溶液，在氧化過程中pH變化類似，并且始終保持pH在4.00以下。

圖2 不同初始pH的含鐵培養(yǎng)基和不含鐵培養(yǎng)基的含菌實(shí)驗(yàn)溶液As離子質(zhì)量濃度變化

圖3 不同初始pH的無鐵有菌和有鐵有菌實(shí)驗(yàn)溶液pH值變化

對(duì)比無鐵培養(yǎng)基有菌(Y2、Y3、Y3.5)和有鐵培養(yǎng)基有菌(FeY2、FeY3、FeY3.5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)，初始pH2.00的溶液在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，始終保持pH<4.0的酸性環(huán)境，F(xiàn)e2+對(duì)溶液pH變化影響不大。但初始pH3.00和3.50的溶液，無鐵培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)溶液第1天后，pH迅速上升到7.0以上，之后有緩慢下降，但保持在較高的pH5.0～8.0之間；而含鐵培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)溶液中卻始終保持pH在4.0以下，結(jié)果說明Fe2+對(duì)毒砂氧化過程保持低pH溶液起重要作用。

3.4 氧化亞鐵硫桿菌對(duì)毒砂氧化溶液As離子質(zhì)量濃度的影響

圖4分別表示出了初始pH2.00、3.00和3.50的含鐵無菌和含鐵含菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可見反應(yīng)的前11 d，含菌與不含菌實(shí)驗(yàn)溶液As離子質(zhì)量濃度和變化趨勢(shì)基本一致，但第11天后，無菌實(shí)驗(yàn)溶液As離子質(zhì)量濃度變化比較復(fù)雜，含菌實(shí)驗(yàn)液As離子質(zhì)量濃度穩(wěn)步上升，而且30 d后總體上(除了初始pH3.00第30天的數(shù)據(jù)之外)含菌實(shí)驗(yàn)溶液As離子質(zhì)量濃度比不含菌實(shí)驗(yàn)溶液As離子質(zhì)量濃度要高。但從實(shí)驗(yàn)階段的結(jié)果來看，無菌和含菌氧化實(shí)驗(yàn)溶液As離子質(zhì)量濃度差別不是很大，這可能說明Fe2+的加入，改變的溶液的pH值(保持低pH值)，對(duì)毒砂氧化起更重要的作用。

圖4 不同初始pH的無菌和含菌含鐵培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)溶液As離子質(zhì)量濃度變化

4 結(jié) 論

在初始pH為2.00、3.00和3.50的酸性條件下，利用A.f對(duì)毒砂進(jìn)行為期30 d的氧化模擬實(shí)驗(yàn)，獲得如下結(jié)論：

1)在pH值為2.00～3.50的極端酸性環(huán)境下，低pH可促進(jìn)毒砂的微生物氧化作用。

2)Fe2+會(huì)使毒砂生物氧化過程pH保持在4.0以下進(jìn)行，促進(jìn)毒砂氧化，提高釋放的As離子質(zhì)量濃度。

致謝：感謝中山大學(xué)地球科學(xué)與地質(zhì)工程學(xué)院張恩副教授為本文提供毒砂樣品。

參考文獻(xiàn)：

[1]RIMSTIDT J D, CHERMAK J A, GAGEN P M. Rates of reaction of galena, sphalerite, chalcopyrite, and arsenopyrite with Fe (Ⅲ) in acidic solutions, Environmental geochemistry of sulfide oxidation[J]. American Chemical Society,1994: 3-13.

[2]JOHNSON D B, HALLBERG K B. Acid mine drainage remediation options: a review [J]. Sci Total Environ,2005, 338: 3-14.

[3]BELZILE N, CHEN Y W, CAI M F, et al. A review on pyrrhotite oxidation[J].Geochem, Explor,2004, 84: 65-76.

[4]SCHIPPERS A, KOCK D, SCHWARTZ M, et al. Geomicrobiological and geochemical investigation of a pyrrhotite-containing mine waste tailings dam near Selebi-Phikwe in Botswana [J]. J Geochem Explor,2007, 92 : 151-158.

[5]CORKHILL C L, VAUGHAN D J. Arsenopyrite oxidation-A review [J]. Applied Geochemistry, 2009,24: 2342-2361.

[6]陸建軍，陸現(xiàn)彩，王睿勇，等．金屬礦山環(huán)境中礦物的微生物分解及環(huán)境效應(yīng)研究進(jìn)展[J]．高校地質(zhì)學(xué)報(bào)，2007，13(4)：621-629．

[7]蔣磊，周懷陽，彭曉彤．氧化亞鐵硫桿菌對(duì)黃鐵礦、黃銅礦和磁黃鐵礦的生物氧化作用研究[J]．科學(xué)通報(bào)，2007，52(15)：1802-1813．

[8]郁云妹, 朱詠煊 ,高振敏，等．地表?xiàng)l件下毒砂氧化作用與水溶液pH 的關(guān)系[J].礦物學(xué)報(bào)，2007，27 (3/4)：235-240．

[9]張珊珊，周懷陽，彭曉彤．氧化亞鐵硫桿菌與毒砂相互作用的階段性及其機(jī)理研究[J] .地球化學(xué)，2008，37(6)：601-614．

[10]朱婷婷，陸現(xiàn)彩，李娟，等．Acidithiobacillusferrooxidans氧化分解毒砂的次生產(chǎn)物研究[J]．地球化學(xué)，2011，31(4)：683-691．

[11]王智美，陳炳輝，江春苗，等．粵北大寶山酸性礦山廢水氧化亞鐵硫桿菌及其相關(guān)性能研究[J] . 中山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2010，49(5)：146-149．