宋 波， 郭 佳， 袁華平， 關(guān) 鋒

(1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122 2. 江蘇省昆山市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 昆山 215301)

糖生物學(xué)研究已成為21世紀(jì)生命科學(xué)的前沿和熱點(diǎn)領(lǐng)域之一，而糖鞘脂的結(jié)構(gòu)和功能是糖生物學(xué)研究的主要內(nèi)容。糖鞘脂廣泛分布于腦組織神經(jīng)細(xì)胞的膜表面，具有促進(jìn)神經(jīng)再生、軸突生長、突觸形成以及恢復(fù)神經(jīng)支配等功能[1]，是細(xì)胞膜表面脂筏的重要組成部分，對脂筏的形成和穩(wěn)固有著重要作用，并能促使膽固醇在脂筏中偏向胞質(zhì)一側(cè)分布[2]。糖鞘脂還參與了細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡、黏附及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[3-6](圖1)。最新研究[7]發(fā)現(xiàn)某些糖鞘脂參與了細(xì)胞癌變的重要過程——上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(胚胎發(fā)育和惡性腫瘤發(fā)展的一個(gè)重要過程，細(xì)胞由正常的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞，遷移能力和侵襲能力得到顯著增強(qiáng))。

糖鞘脂四糖基腦酰胺Gg4是由糖鏈、長鏈脂肪酸和鞘氨醇(Sphingosine)的長鏈堿基3部分組成的兩性分子，主要富集于細(xì)胞膜上不溶于Triton X-100的區(qū)域，在可溶于Triton X-100的膜組分中，Gg4也有表達(dá)，但表達(dá)量極少[8]。本課題組前期工作中用轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β處理NMuMG細(xì)胞使之發(fā)生EMT過程，發(fā)現(xiàn)Gg4顯著下調(diào)，而在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加Gg4可以顯著抑制NMuMG細(xì)胞發(fā)生EMT，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)也證明Gg4與E-鈣黏蛋白和β-連鎖蛋白存在相互作用，從而提出Gg4可以鞏固E-鈣黏蛋白/β-連鎖蛋白復(fù)合體的模型[9-12]。

圖1 糖鞘脂的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能(Sen-itiroh Hakomori, PNAS, 2002)

本文以NMuMG細(xì)胞為研究對象，運(yùn)用基因工程技術(shù)將鼠源β3GalT4基因的全長序列和沉默β3GalT4表達(dá)的shRNA分別克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)和pSUPER-retro中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NMuMG，構(gòu)建β3GalT4過表達(dá)和β3GalT4沉默NMuMG細(xì)胞株，通過薄層層析和免疫印跡驗(yàn)證了在兩個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中Gg4表達(dá)分別上調(diào)和下調(diào)，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩株細(xì)胞的遷移能力分別降低和增強(qiáng)，證實(shí)Gg4在細(xì)胞遷移方面具有重要的生物學(xué)功能。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌 JM109、真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)和pSUPER-retro由本實(shí)驗(yàn)室保存；小鼠胸腺上皮細(xì)胞NMuMG來自于美國模式培養(yǎng)物集存庫ATCC。

細(xì)胞RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和Ultra SYBR Mixture Real-Time試劑盒購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Rever Tra Ace-α-逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和DNA 高效Ligase購于TOYOBO公司；限制性內(nèi)切酶、DNA Ladder marker、DNA切膠回收試劑盒和純化試劑盒購于Takara公司；DNA聚合酶購于天根生化科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素/鏈霉素溶液購于Life technologies公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購于Invitrogen公司；抗生素、胰島素和氯金酸購于Sigma公司；糖脂標(biāo)準(zhǔn)品購于MATREYA公司；TKH7由美國Biomembrane研究所S. Hakomori教授惠贈(zèng)；Westar Nova 2011顯色液購于CYANAGEN公司；Goat anti-Mouse IgM-HRP購于Southern Biotech公司；HPTLC Silica gel 60 F254薄層層析板購于EMD Chemicals公司；DISCOVERY DPA-6S柱購于SUPELCO公司；MTT試劑購于煙臺賽爾斯生物技術(shù)有限公司；引物合成及測序由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1β3GalT4過表達(dá)和沉默真核表達(dá)載體的構(gòu)建

通過PCR擴(kuò)增鼠源β3GalT4基因CDS區(qū)(引物見表1)，克隆至pcDNA3.1(+)；根據(jù)RNA干擾原則在β3GalT4基因CDS區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)合成3段靶序列(引物見表1)，克隆至pSUPER-retro，分別轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR(引物見表1)，并提取質(zhì)粒后單、雙酶切驗(yàn)證，陽性克隆經(jīng)上海英濰捷基公司測序鑒定得到進(jìn)一步確認(rèn)。獲得正確的重組質(zhì)粒，分別命名為pcDNA3.1(+)/β3GalT4和pSUPER-retro/β3GalT4 shRNA1, 2和3號。

表1 實(shí)驗(yàn)中的相關(guān)引物

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及β3GalT4過表達(dá)和沉默細(xì)胞株的篩選

NMuMG細(xì)胞在含10%(v/v)胎牛血清、10 μg/mL胰島素、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基、37℃下含5%(v/v)CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。參照LipofectamineTM2000說明書，將重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/β3GalT4和pSUPER-retro/β3GalT4 shRNA 1, 2, 3號轉(zhuǎn)染NMuMG細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后分別加入終濃度600 μg/mL G418和4 μg/mL Puro篩選2周。挑取單細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，Real-Time PCR及半定量PCR(引物見表1)篩選β3GalT4過表達(dá)和沉默的NMuMG單克隆細(xì)胞株。

1.2.3 糖鞘脂的提取

按文獻(xiàn)[13]方法提取細(xì)胞糖鞘脂。提取后，將提取物上樣DISCOVERY DPA-6S柱，用10倍柱床體積的ddH2O對樣品進(jìn)行脫鹽處理后，加入2 mL氯仿/甲醇(v/v=2/1)洗脫并收集，提取物在氮?dú)庀麓蹈珊蠹尤?00 μL氯仿/甲醇(v/v=2/1)復(fù)溶，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 薄層層析和免疫印跡分析糖鞘脂的表達(dá)差異

按文獻(xiàn)[14]方法薄層層析分析糖鞘脂的表達(dá)。每一樣品在硅膠板上對稱點(diǎn)樣2次，展層后切割硅膠板，一半用于地衣酚顯色，另一半用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)。Gg4免疫印跡：切割后，將硅膠板浸泡于1% BSA/PBS(w/v)中，室溫震蕩封閉30 min，加入Gg4抗體TKH7(TKH7∶1% BSA/PBS=1∶5, v/v)，室溫震蕩孵育2 h后TBS-T清洗3次，每次5 min。加入HRP標(biāo)記的IgM(IgM∶1% BSA/PBS=1∶5000, v/v)，室溫震蕩1 h后TBS-T清洗3次，每次5 min。將底物試劑A和B等體積混合制備顯色液淋洗硅膠板，暗室曝光拍照。

1.2.5 膠體金及MTT實(shí)驗(yàn)

膠體金實(shí)驗(yàn)：六孔板每孔加入2 mL過濾的1% BSA(w/v)，室溫孵育3 h后吸出BSA，無水乙醇清洗1次，室溫干燥1 h。按文獻(xiàn)[15]方法配制膠體金懸液。六孔板每孔加入2 mL膠體金懸液，室溫沉淀40 min后棄上清，用無血清培養(yǎng)基清洗1次，加入2 mL細(xì)胞懸濁液(每孔約1500個(gè)細(xì)胞)，37℃培養(yǎng)18 h，拍照分析細(xì)胞遷移。

MTT實(shí)驗(yàn)：24孔板每孔接2×104個(gè)細(xì)胞，37℃分別培養(yǎng)20 h、40 h和60 h后加入20 μL MTT試劑，37℃孵育4 h，棄上清，每孔加入700 μL DMSO，混勻后，取200 μL至96孔板中，測OD595分析細(xì)胞增殖。

2 結(jié)果與分析

2.1 pcDNA3.1(+)/β3GalT4表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

依照實(shí)驗(yàn)方法篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒后進(jìn)行EcoR I、XhoI雙酶切和EcoR I單酶切驗(yàn)證。雙酶切后2個(gè)片段分別為1.1 kb和5.4 kb(泳道2)，單酶切后片段大小為6.5 kb(泳道3)，符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的預(yù)期大小?；驕y序結(jié)果也與Genebank中鼠源β3GalT4序列完全一致，表明pcDNA3.1(+)/β3GalT4表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖2)。

圖2 重組表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/β3GalT4的酶切驗(yàn)證

1—DL2000 DNA Marker；2—重組質(zhì)粒雙酶切；3—重組質(zhì)粒單酶切；4—1 kb DNA Marker。

2.2 pSUPER-retro/β3GalT4 shRNA1, 2和3號表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

以pSUPER-retro/β3GalT4 shRNA1號為例。篩選轉(zhuǎn)化子菌落PCR、EcoR I和XhoI雙酶切及BglⅡ單酶切驗(yàn)證。pSUPER-retro和轉(zhuǎn)化子菌落PCR擴(kuò)增片段分別為240 bp(泳道2)和300 bp(泳道3)，雙酶切片段大小分別為238 bp(泳道4)和298 bp(泳道5)；pSUPER-retro單酶切后被切開(泳道6)，轉(zhuǎn)化子由于插入shRNA序列致使BglⅡ酶切位點(diǎn)發(fā)生改變而不能被切開(泳道7)，結(jié)果與預(yù)期的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符?；驕y序證實(shí)pSUPER-retro/β3GalT4 shRNA1號表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖3)。

圖3 重組表達(dá)載體pSUPER-retro/β3GalT4 shRNA1號菌落PCR及酶切驗(yàn)證

1—50 bp DNA Marker；2—pSUPER-retro PCR；3—轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的JM109菌落PCR；4—pSUPER-retroEcoR I和XhoI雙酶切；5—重組質(zhì)粒EcoR I和XhoI雙酶切；6—pSUPER-retroBglⅡ單酶切；7—重組質(zhì)粒BglⅡ單酶切；8—1 kb DNA Marker。

2.3 β3GalT4過表達(dá)NMuMG細(xì)胞株的篩選

通過Real-Time PCR篩選β3GalT4過表達(dá)NMuMG細(xì)胞株。對比轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的NMuMG細(xì)胞，編號2-7-2和2-7-5細(xì)胞株的2-△△CT值分別為7.12和8.42，P-value均為0.001(圖4A)，表明2株細(xì)胞中β3GalT4顯著上調(diào)。2-7-5細(xì)胞株半定量PCR驗(yàn)證：以tubulin作對照(泳道4和5)，2-7-5細(xì)胞株(泳道3)β3GalT4表達(dá)水平顯著高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒NMuMG細(xì)胞株(泳道2)圖4B。結(jié)果表明：篩選到的2-7-5細(xì)胞株為β3GalT4過表達(dá)NMuMG細(xì)胞株。

圖4 Real-Time PCR和半定量PCR篩選β3GalT4過表達(dá)細(xì)胞株

A—編號2-7-2和2-7-5細(xì)胞株Real-time PCR； B—編號2-7-5細(xì)胞株半定量PCR。1—DL2000 DNA Marker；2—轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒NMuMG細(xì)胞β3GalT4 PCR；3—編號2-7-5細(xì)胞株β3GalT4 PCR；4—轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒NMuMG細(xì)胞tubulinPCR；5—編號2-7-5細(xì)胞株tubulinPCR。

2.4 β3GalT4沉默NMuMG細(xì)胞株的篩選

通過Real-Time PCR篩選β3GalT4沉默NMuMG細(xì)胞株：對比轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的NMuMG細(xì)胞，編號1-1和2-3細(xì)胞株的2-△△CT值分別為0.575和0.950，P-value分別為0.0002和0.063(圖5A)，表明1-1號細(xì)胞株β3GalT4表達(dá)下調(diào)。1-1細(xì)胞株半定量PCR驗(yàn)證：以tubulin作對照(泳道4和5)，1-1細(xì)胞株(泳道3)β3GalT4表達(dá)水平低于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒NMuMG細(xì)胞株(泳道2)(圖5B)。結(jié)果表明：篩選到的1-1細(xì)胞株為β3GalT4沉默NMuMG細(xì)胞株。

圖5 Real-Time PCR和半定量PCR篩選β3GalT4沉默細(xì)胞株

A—編號1-1和2-3號細(xì)胞株Real-time PCR；B—編號1-1號細(xì)胞株半定量PCR。1—DL2000 DNA Marker；2—轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒NMuMG細(xì)胞β3GalT4 PCR；3—1-1細(xì)胞株β3GalT4 PCR；4—轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒NMuMG細(xì)胞tubulinPCR；5—1-1細(xì)胞株tubulinPCR。

2.5 β3GalT4過表達(dá)和沉默細(xì)胞株Gg4的表達(dá)

標(biāo)品5 μL、樣品30 μL點(diǎn)樣于硅膠板上。薄層層析實(shí)驗(yàn)表明NMuMG細(xì)胞過表達(dá)β3GalT4 后Gg4表達(dá)上調(diào)(圖6A)，沉默β3GalT4后Gg4表達(dá)下調(diào)(圖6B)；免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)NMuMG細(xì)胞過表達(dá)β3GalT4后 Gg4顯著上調(diào)(圖6C)，沉默β3GalT4后細(xì)胞株Gg4表達(dá)下調(diào)(圖6D)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：過表達(dá)和沉默NMuMG細(xì)胞β3GalT4后 Gg4分別顯著上調(diào)和下調(diào)。

圖6 β3GalT4過表達(dá)、沉默和NMuMG細(xì)胞株Gg4薄層層析及免疫印跡

A)β3GalT4過表達(dá)和NMuMG細(xì)胞株糖鞘脂薄層層析；B)β3GalT4沉默和NMuMG細(xì)胞株糖鞘脂薄層層析；C)β3GalT4過表達(dá)細(xì)胞株的Gg4免疫印跡；D)β3GalT4沉默細(xì)胞株的Gg4免疫印跡。

2.6 過表達(dá)和沉默Gg4對NMuMG細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞遷移和細(xì)胞增殖的影響

圖7 過表達(dá)和沉默Gg4對NMuMG細(xì)胞水平的影響

A—細(xì)胞照相(×100倍)； A上—細(xì)胞形態(tài)； A下—細(xì)胞遷移；B— 細(xì)胞遷移；C—細(xì)胞增殖。

對Gg4過表達(dá)、沉默及NMuMG細(xì)胞株培養(yǎng)24 h顯微照相觀察。轉(zhuǎn)染株細(xì)胞形態(tài)與NMuMG相比無明顯變化(圖7A)。膠體金檢測細(xì)胞遷移表明：過表達(dá)Gg4后，NMuMG細(xì)胞遷移能力明顯降低；沉默Gg4后，NMuMG細(xì)胞遷移能力略有增加(圖7A、B)。將3種細(xì)胞株以相同接種量分別培養(yǎng)20 h、40 h和60 h，通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況，結(jié)果表明過表達(dá)和沉默Gg4對NMuMG細(xì)胞增殖都沒有顯著影響(圖7C)。

3 討論

對糖鞘脂Gg4的研究報(bào)道并不多，這可能與Gg4在細(xì)胞中定位和表達(dá)量有關(guān)。已有報(bào)道證明Gg4分布于Hela細(xì)胞和小鼠自然殺傷細(xì)胞膜表面的脂筏區(qū)域，當(dāng)巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞被激活后，自然殺傷細(xì)胞中的Gg4表達(dá)顯著增高[16]。Feldman等人發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)的鞭毛蛋白可以結(jié)合宿主細(xì)胞膜上的Gg4，從而逃逸宿主細(xì)胞反應(yīng)[17]。Gg4和Toll樣受體5(Toll-like receptor 5)互相作用，介導(dǎo)鈣離子的瞬間流入和ATP從細(xì)胞內(nèi)的釋放，而流入的鈣離子導(dǎo)致了胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase, ERK)信號通路的激活[18]。

本研究利用基因工程技術(shù)將β3GalT4在NMuMG細(xì)胞中過表達(dá)及沉默，構(gòu)建了β3GalT4過表達(dá)和沉默NMuMG永久轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。在β3GalT4過表達(dá)轉(zhuǎn)染株中，Gg4的表達(dá)顯著增加，細(xì)胞遷移能力降低，而在β3GalT4沉默的細(xì)胞株中，Gg4的表達(dá)下降，細(xì)胞遷移能力升高(圖6和7)，證實(shí)了Gg4具有抑制細(xì)胞遷移的生物學(xué)功能。結(jié)合課題組前期的研究結(jié)果，Gg4可以鞏固E-鈣黏蛋白和β-連鎖蛋白的相互作用，增加細(xì)胞粘附，這也可能是Gg4抑制細(xì)胞遷移的原因。此外，實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用基因沉默技術(shù)抑制β3GalT4基因的表達(dá)，效率約50%，若采用基因敲除技術(shù)徹底抑制Gg4的表達(dá)，可深入研究Gg4與其他蛋白或者受體相互作用、Gg4在膜上的定位以及對相關(guān)信號通路的影響。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)Gg4在抑制細(xì)胞遷移方面具有重要作用，鑒于細(xì)胞粘附和遷移對癌癥發(fā)生發(fā)展尤其是EMT過程具有重要意義，因此，本研究為Gg4在EMT過程中功能的行使提供了力證。另外，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的Gg4過表達(dá)和沉默永久轉(zhuǎn)染NMuMG細(xì)胞株可為研究Gg4鞏固E-鈣黏蛋白/β-連鎖蛋白復(fù)合體的分子機(jī)制提供良好的細(xì)胞模型，也可為進(jìn)一步探索其新的功能做出貢獻(xiàn)。

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