邱亨池，王琪琳，何雨潔，侯夏樂，李 露，郭文洋，康振生，韓德俊

(西北農(nóng)林科技大學(xué) a 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，b 農(nóng)學(xué)院，c 植物保護學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

小麥條銹病是由病原條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici,Pst)引起的氣流傳播性小麥病害，其傳播速度快，危害范圍廣、程度高[1]。自建國以來，小麥條銹病在我國有多次比較大的流行，給我國糧食生產(chǎn)造成了巨大的損失。運用抗病品種、改良抗病基因、合理基因布局是防治小麥條銹病最簡便、有效、經(jīng)濟且對環(huán)境友好的措施。我國小麥栽培品種遺傳基礎(chǔ)狹窄，抗病基因單一，原始抗源主要集中在南大、阿夫、阿勃、青春系等單一品系材料中[2]，而隨著小麥條銹菌的不斷變異進化，這些抗病材料的抗銹性迅速被克服。如今，各麥區(qū)栽培的小麥抗病品種的抗病基因主要為Yr26，其對各麥區(qū)廣泛流行的致病菌系CYR32、CYR33有很好的抗性。而新近于四川省發(fā)現(xiàn)的新條銹菌致病菌系CH42已克服抗病基因Yr26的抗性，值得特別關(guān)注。成株期抗性具有抗譜廣、延緩病害流行、防病保產(chǎn)和延長抗病持久性等特點[3]。因此，加強對成株期抗性材料的收集和研究對于條銹病防治具有十分重要的意義。

秦農(nóng)142是以鄭州8329為母本、植87135-2-1-2-9為父本雜交選育而成的小麥新品種，其農(nóng)藝性狀優(yōu)良，產(chǎn)量高，對白粉病、赤霉病及紋枯病抗性良好[4]。本課題組連續(xù)多年在陜西楊凌和甘肅天水兩地自然條件下對秦農(nóng)142苗期和成株期抗性進行鑒定，發(fā)現(xiàn)其苗期對少數(shù)條銹菌菌系表現(xiàn)中度或高度感病，而成株期表現(xiàn)為廣譜抗條銹病特征，具有成株期抗病性。為了更好地利用秦農(nóng)142的成株期抗銹性，發(fā)掘其抗條銹新基因，本研究利用基因推導(dǎo)和Yr基因分子檢測等手段，分析秦農(nóng)142可能攜帶的抗銹病基因，并通過與感病品種Avocet S(AvS)雜交，分析各世代的抗性表現(xiàn)，以明確秦農(nóng)142成株期抗條銹病的遺傳規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材 料

本試驗用12個條銹菌菌系進行抗病接種鑒定，其中巴基斯坦菌系PK-CDRD、匈牙利菌系Hu09-2和澳大利亞菌系104E137A為國外優(yōu)勢流行小種，由華盛頓州立大學(xué)陳賢明教授惠贈；CYR23、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、CH42、Sull-4、Sull-5和Sull-7等9個條銹菌菌系由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物病理研究所提供。其中，CYR23、CYR29、CYR31小種是我國20世紀(jì)末期各麥區(qū)優(yōu)勢流行小種；CYR32、CYR33是我國當(dāng)前各麥區(qū)優(yōu)勢流行小種；Sull-4、Sull-5、Sull-7為潛在的優(yōu)勢流行小種；CH42為新近在四川麥區(qū)發(fā)現(xiàn)的小種[5]，其可以侵染攜帶抗銹病基因Yr26的小麥，也是潛在的流行小種。所有條銹菌菌系經(jīng)過鑒定、純化后，隔離繁殖備用。7個已知抗條銹病單基因系抗性材料(Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18、Yr26)由華盛頓州立大學(xué)陳賢明教授提供；抗病材料秦農(nóng)142及感病材料AvS和Chinese Spring(CS)由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物病理研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 成株期抗條銹性鑒定 2010-2012年，分別在陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)植物病理研究所人工混合小種誘發(fā)圃和甘肅天水自然誘發(fā)圃種植抗病品種秦農(nóng)142及感條銹病對照材料AvS和CS，鑒定秦農(nóng)142成株期的抗性水平。

1.2.2 苗期分小種抗性鑒定 小麥苗期抗性鑒定在西北農(nóng)林科技大學(xué)植物病理學(xué)研究所溫室進行。將秦農(nóng)142及7個已知抗條銹病單基因系材料種植在直徑為10 cm的瓦盆中，待小麥幼苗生長至2葉完全伸展時，采用抖粉法分別接種12個條銹菌菌系的孢子，在16～18 ℃條件下于保濕桶中存放24 h后，轉(zhuǎn)至溫室中培養(yǎng)，條件為：溫度22 ℃以下，光照強度9000 lx，16 h/8 h光暗周期。以感病品種AvS和CS為對照。待對照品種充分發(fā)病后(接種后約15～18 d)，記載抗條銹病單基因系材料和親本秦農(nóng)142的抗病表型，按文獻[6]中的方法，以 0-9 級標(biāo)準(zhǔn)記載抗病反應(yīng)型(Infection type,IT)，按0，1%，5%，10%，30%，60%，80%和 100% 8級標(biāo)準(zhǔn)記載嚴(yán)重度(Severity，S)[1]。

1.2.3 已知抗病基因的分子檢測 取秦農(nóng)142新鮮不帶條銹菌菌落的葉片，運用CTAB法提取基因組DNA，保存在-20 ℃冰箱中備用。以單基因系抗性材料為陽性對照，AvS為陰性對照，以應(yīng)用廣泛的抗條銹病基因Yr5[7]、Yr9[8]、Yr10[9]、Yr15[10]、Yr17[11]、Yr18[12]及Yr26[13]的分子標(biāo)記對親本材料秦農(nóng)142進行分子標(biāo)記檢測，各基因分子標(biāo)記的引物信息見表1，按照文獻[7]的方法進行PCR擴增和產(chǎn)物檢測。

1.2.4 秦農(nóng)142成株期抗條銹性遺傳分析 以秦農(nóng)142為父本，與母本AvS雜交,獲得F1代。將F1套袋自交獲得F2群體，群體大小為212個單株。對F2群體接種混合條銹菌小種，以鑒定其成株期抗條銹性，記載單株的抗病反應(yīng)型和嚴(yán)重度，分析抗感分離比。F2單株收獲得F2∶3家系群體，記載F2∶3家系的抗病反應(yīng)型和嚴(yán)重度，并根據(jù)F2∶3家系的抗病表型，驗證F2單株抗病性鑒定結(jié)果，并推測其抗病基因型。

表1 已知抗小麥條銹病基因的分子標(biāo)記

2 結(jié)果與分析

2.1 秦農(nóng)142成株期抗條銹性的鑒定

連續(xù)3年在楊凌人工混合小種誘發(fā)圃和天水自然誘發(fā)圃的抗病性鑒定結(jié)果(表2)表明，抗條銹病品種秦農(nóng)142在兩地均為高度抗病(IT≤2，S≤5%)，而對照感病品種AvS在兩地均表現(xiàn)為高度感病(IT≥8，S≥80%)；CS在兩地除2010年人工誘發(fā)圃嚴(yán)重度為60%外，其余均表現(xiàn)為高度感病(IT≥8，S≥80%)。說明抗病品種秦農(nóng)142在成株期具有高度的抗病性。

表2 秦農(nóng)142小麥成株期抗病表型

2.2 秦農(nóng)142苗期抗病表現(xiàn)及抗病基因推導(dǎo)

苗期抗病性鑒定結(jié)果(表3)顯示，秦農(nóng)142苗期對當(dāng)前各麥區(qū)優(yōu)勢流行菌系CYR32高度感病(IT為8)，對潛在的優(yōu)勢流行小種Sull-4中度抗病(IT為5)，對菌系PK-CDRD也為中度抗病(IT為3)，對其余9個致病菌系表現(xiàn)高度抗病(IT為0～2)，表明抗病品種秦農(nóng)142含有主效抗條銹病基因，但其對毒性小種CYR32沒有抗性，成株期秦農(nóng)142對CYR32的抗性可能由成株期抗病基因決定。

采用12個條銹菌生理小種對秦農(nóng)142的抗病基因分布進行初步篩查，通過與已知含有抗條銹病基因的單基因系材料進行對比，可以對秦農(nóng)142含有的已知抗條銹病基因做出初步斷定。因此，本研究根據(jù)Dubin等[14]提出的基因推導(dǎo)六原則,對比含有已知基因的單基因系材料抗病譜，進而推導(dǎo)秦農(nóng)142中含有的抗病基因。抗條銹病基因Yr5、Yr10及Yr15的抗性譜(表3)顯示，三者對所有供試條銹菌菌系均表現(xiàn)高度抗病，抗條銹病基因Yr26僅對條銹菌菌系CH42表現(xiàn)感病，對其他供試菌系均表現(xiàn)抗病，而秦農(nóng)142苗期對CYR32表現(xiàn)感病，說明秦農(nóng)142中不含抗條銹病基因Yr5、Yr10、Yr15或Yr26?？箺l銹病基因Yr9、Yr17和Yr18的單基因系材料對CYR32均表現(xiàn)感病，對其他供試的11個菌系分別表現(xiàn)不同程度的感病，秦農(nóng)142對相應(yīng)的條銹菌菌系表現(xiàn)為典型的低反應(yīng)型，說明其可能含有抗條銹病基因Yr9、Yr17和Yr18，這需進一步通過分子檢測來確證。

表3 秦農(nóng)142小麥及抗條銹病單基因系小麥材料的苗期抗病譜

2.3 秦農(nóng)142抗病基因的分子標(biāo)記分析

選用7個常見抗條銹病基因已知分子標(biāo)記檢測秦農(nóng)142所含有的抗病基因，結(jié)果(表4)在分子標(biāo)記S19M93的檢測中，通過和Yr5單基因系材料抗病譜(表3)對比分析可知，秦農(nóng)142中不含有Yr5，此處檢測結(jié)果為假陽性；其余6個分子標(biāo)記的檢測結(jié)果均為陰性。綜合基因推導(dǎo)和分子標(biāo)記的檢測結(jié)果可知，秦農(nóng)142中不含有Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18和Yr26等7個已知的抗條銹病基因，其苗期的?；剐钥赡苁怯晌粗共』蛩鶝Q定的，這需要進一步研究。

表4 秦農(nóng)142小麥及抗條銹病單基因系小麥材料的分子標(biāo)記檢測

2.4 秦農(nóng)142成株期抗條銹病的遺傳分析

表5 自然條件下秦農(nóng)142與AvS雜交各世代成株期的抗條銹病表現(xiàn)

3 討 論

具有成株期抗性的小麥品種對條銹菌的抗性表現(xiàn)為廣譜性和持久性，能延緩病害發(fā)生，降低條銹病的危害[15-16]，因此挖掘不同的成株期抗性抗源對小麥持久抗性品種的選育具有重要意義。經(jīng)過多年多點的驗證，秦農(nóng)142不論是在楊凌人工混合小種誘發(fā)圃，還是在病原菌變異頻繁的天水自然誘發(fā)圃，其成株期均表現(xiàn)高度抗病，苗期對當(dāng)前各麥區(qū)流行小種CYR32表現(xiàn)高度感病，表明秦農(nóng)142成株期對CYR32的抗性由成株期抗病基因介導(dǎo)，是典型的成株期抗源品種，具有重要的利用價值。在后期的研究中，應(yīng)擴大遺傳群體，結(jié)合表型數(shù)據(jù)，運用分子標(biāo)記篩選技術(shù)，定位成株期相關(guān)抗病基因[17-18]。

明確抗源所攜帶的抗病基因?qū)乖吹拈_發(fā)利用至關(guān)重要。本研究中，苗期以12個條銹菌致病菌系進行接種鑒定，結(jié)果表明秦農(nóng)142苗期對供試條銹菌菌系CYR32感病，對其他11個菌系均表現(xiàn)高度抗病或中度抗病，表明其苗期抗病表型良好，含有苗期小種?；共』?。采用基因推導(dǎo)的方法建立7個已知抗病基因的抗性譜，對比分析秦農(nóng)142的抗病表現(xiàn)，推測其苗期抗病主效基因。基因推導(dǎo)法則是由Dubin等在總結(jié)前人經(jīng)驗的基礎(chǔ)上提出的，為利用材料的抗病表現(xiàn)推斷其基因型，并摸清其遺傳特點提供了方法和指導(dǎo)。基因推導(dǎo)方法容易受寄主遺傳背景、病原物鑒別力、環(huán)境條件及人為因素的影響而造成誤差[19]。本試驗結(jié)合分子標(biāo)記檢測技術(shù)，對其所攜帶苗期小種專化抗條銹病基因存在與否提供了另一方面的證據(jù)，從而使試驗結(jié)果更加準(zhǔn)確和可靠[20]。通過在楊凌建立F1、F2遺傳群體及衍生F2∶3遺傳家系，遺傳分析結(jié)果表明，秦農(nóng)142成株期抗病性是由1對顯性和1對隱性基因共同決定的。本研究明確了秦農(nóng)142苗期和成株期的抗病特征，初步篩查了其苗期小種?；共』?，分析了成株期的抗病遺傳機制，為后續(xù)更加深入地研究及挖掘抗病基因奠定了一定的基礎(chǔ)。秦農(nóng)142苗期抗病表型優(yōu)異，成株期具有廣譜抗條銹病的特征，是很好的抗條銹病育種材料。

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