樊家榮， 孟想想， 曹 可

(合肥學院 生物與環(huán)境工程系，合肥 230601)

大花蕙蘭(Cymbidium)為蘭科植物，又稱虎頭蘭，株型高大優(yōu)美，花期長達2～3個月，花大色彩艷麗豐富，花朵數(shù)多排列有序，花姿粗曠豪放，葉長碧綠優(yōu)雅，它既有國蘭的幽香典雅，又有洋蘭的豐富多彩，具有較高的觀賞和經(jīng)濟價值，深受蘭花愛好者歡迎，在國際花卉市場十分暢銷[1-3]，市場發(fā)展前景遠大。花大色艷新品種多數(shù)為蘭屬的雜交種多倍體[3-4]，種子高度不育，分株繁殖速度慢，遠不能滿足市場需求，采用組織培養(yǎng)是快速繁殖大花蕙蘭種苗的有效途徑。我國云南、沿海地區(qū)從20世紀末就開始進行組織培養(yǎng)研究[5-6]，已取得可喜的成績，據(jù)了解本地未曾有人研究大花蕙蘭組織培養(yǎng)，至今還是一花難求。

實驗采用1/2MS[3-6]為基本培養(yǎng)基，選用大花蕙蘭雜交種1053新生苗為外植體，對大花蕙蘭組培關鍵階段：類原球莖誘導、類原球莖增殖與分化、芽增殖、誘導生根培養(yǎng)的最佳激素濃度配比、有機添加物等影響因素進行研究，優(yōu)化后的大花蕙蘭組培快繁種苗技術，具有繁殖率高、周期短、成本低等優(yōu)點，可提高市場競爭力，促進本地大花蕙蘭產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大花蕙蘭1053品種購買于云南呈貢斗南花卉市場，無菌瓶苗由本實驗室培養(yǎng)，以盆栽的新生苗、無菌苗莖段和葉為外植體。

1.2 實驗方法

1.2.1 基本培養(yǎng)基

采用1/2MS+蔗糖20 g/L+瓊脂8 g/L+Vc5 mg/L，pH值5.8。

1.2.2 大花蕙蘭類原球莖誘導

1)培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基添加150 ml/L椰汁，設計6-BA(0.3、0.5、1.0、1.5 mg/L)和NAA(0.2、0.5 mg/L)6種不同濃度組合的培養(yǎng)基(表1)。

2)外植體制備與接種：鱗莖取自盆栽大花蕙蘭長有5～6片葉的新生苗，連稍微膨大的假鱗莖一起挖取，用自來水沖洗干凈，剝?nèi)?nèi)層假鱗莖，在超凈工作臺中。先用75%的酒精浸泡35 s，再用0.1%的升汞[7-8]浸泡9 min，無菌水浸泡4～5 min、沖洗2次。切去表層，以莖尖生長點為中心切取直徑約0.6 cm組織塊，每瓶接種1塊。幼葉橫切成長0.8 cm的片狀，每瓶接種10片；莖節(jié)切成1 cm長的小段，每瓶接種4段，培養(yǎng)50 d統(tǒng)計結果。

3)培養(yǎng)條件：溫度為晝26℃、夜20℃；光照時間12 h/d，光照強度為1500 lx。

1.2.3 類原球莖增殖與分化芽

基本培養(yǎng)基添加椰汁同上，設計6-BA(0、0.3、0.5、1.0、1.5 mg/L)和NAA(0、0.2、0.3、0.5 mg/L)7種不同濃度配比培養(yǎng)基(表2)。選擇顆粒飽滿、色澤黃綠的類原球莖為外植體，分割4個一組，每瓶接種5組，培養(yǎng)45d統(tǒng)計結果。

1.2.4 大花蕙蘭幼芽增殖

將幼芽分割成兩個1組，每瓶接種2組，每種培養(yǎng)基接25瓶，培養(yǎng)50 d統(tǒng)計結果。

1)激素濃度對芽增殖的影響 設計6-BA(1.0、2.0、3.0 mg/L)和NAA(0.1、0.2、0.5、1.0 mg/L)7種不同濃度配比的培養(yǎng)基(表3)。

2)有機添加物對芽增殖的影響 選用芽增殖最佳的激素濃度配比6-BA 2.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L，設計添加物分別是椰汁(100、150、200 ml/L)、香蕉泥(100、150 g/L)，無添加物的為對照組6種培養(yǎng)基(表4)。

3)芽增殖正交試驗 采用三因素三水平正交試驗(表5)，探討出影響芽增殖因素的主次順序和最優(yōu)組合(表6)。

1.2.4 大花蕙蘭幼苗誘導生根

基本培養(yǎng)基添加香蕉泥100 g/L，設計IBA(0.1、0.3、0.5 mg/L)和NAA(0、0.1、0.2、0.4 mg/L)6種不同激素濃度的培養(yǎng)基(表7)。待幼苗長有3～4片葉、高3～4 cm、苗體健壯時，分割成單株接入誘導生根培養(yǎng)基。

2結果與分析

2.1 大花蕙蘭類原球莖誘導結果

表1 3種外植體誘導類原球莖的結果

實驗結果(表1)：外植體鱗莖接種3周后長出針尖大的綠色顆粒，約5周形成類原球莖。2號培養(yǎng)基接種鱗莖的莖尖，只誘導出少數(shù)類原球莖并伴有分化芽的趨勢(圖1-1)；接種的鱗莖組織塊培養(yǎng)約7周誘導出許多類原球莖(圖1-2)，顏色黃綠、幼嫩飽滿；接種的莖段培養(yǎng)2～3周兩端長出淡黃色的愈傷組織，之后生長慢，多數(shù)褐化，只有少數(shù)能形成類原球莖，個別莖節(jié)處潛在的芽原基長出1～2個芽；幼葉誘導未果。實驗表明：最佳外植體為鱗莖，添加低濃度的6-BA、NAA，比值在1.5～5的范圍內(nèi)均可誘導出類原球莖，2號培養(yǎng)基激素濃度配比6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.2 mg/L最佳。

2.2 大花蕙蘭類原球莖增殖與分化芽的結果

表2 激素濃度對類原球莖增殖與分化芽的影響

實驗結果(表2)：培養(yǎng)基無外源激素或添加激素濃度低，類原球莖增殖率偏低，生長狀態(tài)差，分化的芽少；6、7號培養(yǎng)基激素濃度高，類原球莖增殖倍數(shù)有所下降。合適的激素配比類原球莖增殖與分化芽可同時進行[9]。綜合考慮5號培養(yǎng)基6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L最佳，增殖的類原球莖個大飽滿數(shù)量多，黃綠鮮亮，分散性好，分化的芽體健壯，有利于繼代培養(yǎng)。45 d 繼代培養(yǎng)1次可獲得大量類原球莖，適當延長培養(yǎng)時間，60 d左右轉(zhuǎn)接1次可收獲更多的芽。

圖1 大花蕙蘭類原球莖誘導和芽增殖

表3 不同激素濃度對幼芽增殖的影響

2.3 大花蕙蘭幼芽增殖的結果

1)激素對幼芽增殖的影響：

實驗結果(表3)，6-BA對芽增殖作用大，隨6-BA濃度升高，芽增殖數(shù)量增加，當超過3 mg/L時，芽體瘦弱發(fā)黃，與低濃度NAA配合使用，促進芽增殖與生長作用更顯著，6-BA(1～2.0)mg/L、NAA(0.2～0.5)mg/L、兩者比值在3～10的范圍內(nèi)，均能促進芽增殖。不同激素因子之間存在復雜的協(xié)同作用[10-12],單獨使用6-BA或NAA增殖效果都不理想。相比5號培養(yǎng)基激素濃度配比6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L最佳，芽增殖倍數(shù)高，芽體健壯，色澤翠綠鮮亮(圖1-3)。

表4 添加物對幼芽增殖的影響

表5 因素水平

2)添加物對幼芽增殖的影響：

實驗結果(表4)，培養(yǎng)基添加椰汁和香蕉泥均能促進芽生長[13-15]，3號培養(yǎng)基芽增殖倍數(shù)高，芽體健壯，色澤翠綠(圖1-4)，相比添加椰汁150 ml/L最佳。

3)芽增殖正交試驗結果(表5、6)：

正交驗證試驗結果(表6)，由R值大小可以看出本實驗因素存在顯著的影響差異，主次順序為：A>C>B， 即6-BA>椰汁添加物>NAA，6-BA濃度對大花蕙蘭芽增殖的影響最大。優(yōu)組合為：A2B2C2，優(yōu)水平為：6-BA2 mg/L、NAA0.5 mg/L、添加物椰汁150 ml/L。

2.4 大花蕙蘭幼苗誘導生根結果

表6 三因素三水平正交驗證試驗結果

表7 激素對幼苗生根的影響

實驗結果(表7)，培養(yǎng)基單獨添加IBA，隨濃度升高根的誘導率增高，苗體瘦弱生長緩慢；5號培養(yǎng)基低濃度IBA與NAA協(xié)同作用生根多、根健壯，生根率100%，平均每株4～5條根；當激素濃度升高IBA 0.5 mg/L、NAA 0.4 mg/L時，生根率雖高，根畸形膨大，移栽不易成活。實驗表明：影響幼苗生根的主要因素是生長素的種類與水平，5號培養(yǎng)基激素配比IBA 0.3 mg/L + NAA 0.2 mg/L最佳，添加100 g/L香蕉泥促進幼苗根生長作用顯著。

3 結論

通過對影響大花蕙蘭組培快繁的單因素和正交試驗研究，優(yōu)化得出：類原球莖誘導最佳外植體為大花蕙蘭鱗莖，培養(yǎng)基最佳激素濃度配比為0.5 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA。類原球莖增殖與分化芽最佳激素濃度配比為1.0 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L NAA。幼芽增殖的最佳激素濃度配比為2.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA，最佳有機添加物為150 ml/L椰汁；幼芽增殖正交試驗結果，影響因素主次順序：6-BA>椰汁添加物>NAA，優(yōu)組合為2 mg/L 6-BA、0.5mg/L NAA、添加物椰汁150 ml/L。誘導生根最佳激素濃度配比為0.3 mg/L IBA + 0.2 mg/L NAA，添加100 g/L香蕉泥對幼苗根生長有顯著的促進作用。優(yōu)化后的大花蕙蘭組培快繁技術，種苗繁育周期短、繁殖率高、成本低，可供大花蕙蘭快速繁殖規(guī)?；a(chǎn)參考。

參考文獻：

[1]藺紅萍,李 培.大花蕙蘭組織培養(yǎng)技術[J].北方園藝,2010(3):138-140.

[2]韓 明,李晏萍,潘雪峰.利用叢生芽增殖途徑對大花蕙蘭進行離體快繁[J].熱帶生物學報,2012(3):262-263.

[3]王麗艷,劉漢云.大花蕙蘭離體培養(yǎng)和快速繁殖技術的研究[J].科技情報開發(fā)與經(jīng)濟,2007,17(8):146 -147.

[4]徐永清,胡國富,李鳳蘭,等.大花蕙蘭莖尖組織培養(yǎng)與植株再生研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2009,40(4): 60-64.

[5]姚麗娟,徐曉薇,陳義增,等.大花蕙蘭原球莖增殖分化影響因素研究[J]. 農(nóng)業(yè)科技通訊, 2008(5): 58-59.

[6]施隆文,孟祥云,莊應強.大花蕙蘭類原球莖增殖與分化影響因素的初步研究[J].北方園藝,2008(4):230-232.

[7]安利國.細胞工程[M].第二版.北京:科學出版社,2009: 91-98.

[8]周 音,張建軍,殷麗青.植物生長調(diào)節(jié)劑對3個大花蕙蘭品種類原球莖及不定芽誘導的影響[J].上海農(nóng)業(yè)學報,2013,29(1):15-19.

[9]宋麗莎,張習敏.大花蕙蘭原球莖誘導和增殖技術的研究[J].貴州農(nóng)業(yè)科學,2010,38(1):10-12.

[10]常美花,王 莉,李文紅.大花蕙蘭組織培養(yǎng)的研究進展及應用[J].北方園藝,2011(7):174-177.

[11]李茂娟,譚柏韜,鄧少華,等.大花蕙蘭無菌播種與組培快繁技術研究[J].湖南輯業(yè)科技,2012,39(3):26-28.

[12]陳威潼,陳小強,許燕萍.激素和添加物對大花蕙蘭組培快繁的影響[J].天津農(nóng)學院學報,2011,18(4):32-34.

[13]張助云,汪希強.大花蕙蘭組培快繁技術[J].北方園藝,2007(3):175～176.

[14]付志惠.大花蕙蘭快速繁殖技術的研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學,2010(3):125-127.

[15]毛紅麗.大花蕙蘭組織培養(yǎng)快繁技術[J].育種與栽培,2012, 23(2):25-26.