王宏剛，陳成彬，王春國，陳 力，宋文芹，白艷玲，張金紅, 劉 方

(南開大學(xué) 生物實驗教學(xué)中心，天津 300071)

熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization, FISH)是20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術(shù)[1-2]。他的基本原理是先把DNA(或RNA)探針用特殊的熒光染料標(biāo)記,然后將探針直接雜交到染色體上,通過熒光染料發(fā)出的熒光來檢測DNA序列在染色體上的定位、定性、相對定量分析。FISH具有安全、快速、靈敏度高、探針能長期保存、能同時顯示多種顏色等優(yōu)點,不但能顯示中期分裂相,還能顯示于間期核。目前，這項技術(shù)已應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域的科學(xué)研究[3-7]。

熒光原位雜交技術(shù)已成為生命科學(xué)類專業(yè)的學(xué)生在進行科研所必需的一項基本實驗技術(shù)。因此，需要在本科生的基礎(chǔ)實驗中設(shè)計相關(guān)的實驗項目，讓每一位生命科學(xué)類專業(yè)的本科生都能夠熟練掌握這項技術(shù)。我們將熒光原位雜交技術(shù)的基本原理和細胞生物學(xué)理論課中關(guān)于染色體端粒的相關(guān)知識結(jié)合在一起，設(shè)計了“端粒序列的熒光原位雜交定位”實驗。通過這個實驗，學(xué)生不但可以掌握熒光原位雜交技術(shù)的原理和實驗方法，還可以對中期染色體的形態(tài)及端粒的位置有更深的認識，鞏固了理論課學(xué)習(xí)的內(nèi)容。

1 實驗材料和試劑

(1) 實驗材料：動物細胞為小鼠淋巴瘤EL4細胞系、倉鼠卵巢CHO細胞系和鼠雜交瘤細胞系；植物材料為水稻、玉米和黑麥。

(2) 實驗試劑：無水乙醇、甲醇、冰醋酸、2.5%果膠酶、2.5%纖維素酶、0.01%秋水仙堿、飽和對二氯代苯水溶液、Giemsa染色液、1640培養(yǎng)基、小牛血清、0.25%的胰蛋白酶、0.075mol的KCl低滲液、70%的去離子甲酰胺、Tween 20、20×SSC、含DAPI的防熒光淬滅劑。

(3) 端粒探針：植物端粒探針FAM-5’TTTAGGGTTTAGGGTTTAGGG 3’ ；動物端粒探針TAMRA-5’TTAGGGTTAGGGTTAGGG 3’

2 實驗方法

2.1 染色體標(biāo)本的制備

2.1.1 植物染色體標(biāo)本的制備

植物材料按常規(guī)培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)，待種子萌發(fā)根尖長至0.5～1 cm后切下生長旺盛的種子根尖，用飽和對二氯代苯溶液室溫預(yù)處理3～5 h；吸去預(yù)處理液，用蒸餾水或0.075 mol/L的KCl低滲30 min；然后用卡諾固定液固定20 min，用蒸餾水洗3次，每次5 min；用2.5%的果膠酶和纖維素酶37 ℃解離根尖1 h；用蒸餾水洗去酶液，再次低滲15 min；倒掉蒸餾水，用3∶1卡諾固定液再次固定20 min；取根尖并置于預(yù)先在蒸餾水中預(yù)冷(4 ℃)的潔凈載玻片上，滴一滴固定液，用鑷子將根尖充分搗碎，再加1滴固定液，將細胞吹散，空氣干燥后用1∶30稀釋的Giemsa染色液染色10 min，自來水沖洗晾干；鏡檢并選擇分散良好的染色體用玻璃筆在反面標(biāo)記位置，-20 ℃冰箱中保存待用。

2.1.2 動物細胞染色體標(biāo)本的制備

將長成單層的貼壁細胞按1∶2進行傳代培養(yǎng)(如果是懸浮培養(yǎng)的細胞可以直接分瓶進行傳代)；36 h后，用質(zhì)量濃度為0.04 mg/L的秋水仙素處理3 h或者低濃度秋水仙素處理過夜；用0.25%的胰蛋白酶處理單層細胞，待細胞收縮變圓時，棄去消化液并加入少許低滲液將細胞從瓶壁上洗脫下來(懸浮細胞可省去這一步)；將細胞移入離心管，1 000 r/min離心10 min，棄上清;加入預(yù)熱的37 ℃的0.075 mol/L的KCl溶液低滲處理15 min;1 000 r/min離心10 min，棄上清;加入新鮮配制的卡諾固定液5 mL，邊加邊將細胞輕輕懸起，固定30 min；離心棄上清，再加5 mL新鮮配制的固定液，固定20 min；離心棄上清，根據(jù)沉淀細胞的多少，加固定液0.5～1 mL制成細胞懸液；吸1滴細胞懸液，距載玻片約20 cm的高度滴于預(yù)冷的干凈載玻片上，迅速對準(zhǔn)細胞吹氣，促進染色體分散；自然干燥后，用1∶20稀釋的Giemsa染色 5 min；鏡檢，選擇分散良好的染色體用玻璃筆在反面標(biāo)記位置，-20 ℃冰箱中保存待用。

2.2 原位雜交

將載玻片在45%的醋酸中浸泡5 min褪色，空氣干燥；在標(biāo)記處加30 μL、70%的去離子甲酰胺/2×SSC，蓋上蓋玻片，于干式恒溫器中70 ℃變性2～4 min；去掉蓋片，-20℃的冷乙醇系列(體積分數(shù)分別為70%，85%，100%)脫水，每級3 min，空氣干燥；每張標(biāo)本加10 μL用2×SSC稀釋探針至5 mg/L探針，蓋上蓋玻片；于濕盒中37 ℃雜交0.5～1.5 h；在4×SSC、0.2%Tween 20中室溫下避光洗滌10 min；蒸餾水沖洗片刻，空氣干燥(避光)；滴加5 μL含有DAPI的防熒光淬滅劑，蓋上蓋玻片；熒光顯微鏡觀察，并用冷CCD拍照。

3 實驗結(jié)果

在熒光顯微鏡下，可以清楚地觀察到經(jīng)DAPI染色后，紫外光激發(fā)染色體發(fā)出的藍色熒光。植物細胞中，藍光激發(fā)同端粒序列結(jié)合的探針上的熒光基團發(fā)出綠色熒光(見圖1—圖3)。動物細胞中，綠光激發(fā)同端粒序列結(jié)合的探針上的熒光基團發(fā)出紅色熒光(見圖4—圖6)。

圖1 玉米端粒熒光原位雜交(100×)

圖2 水稻端粒熒光原位雜交(100×)

圖3 黑麥端粒熒光原位雜交(100×)

圖4 鼠雜交瘤細胞端粒熒光原位雜交(100×)

圖5 倉鼠卵巢CHO細胞端粒熒光原位雜交

圖6 小鼠淋巴瘤EL4細胞端粒熒光原位雜交(100×)

4 注意事項

(1) 染色體標(biāo)本制備注意事項[8-11]：

① 秋水仙素的濃度和處理時間的長短需把握好。處理不足，則染色體過于細長；處理過度，則染色體則會呈短粗狀，均不利于觀察。

② 低滲處理是染色體制備過程中的關(guān)鍵步驟，直接影響染色體形態(tài)好壞。低滲處理時細胞體積膨脹，容易破碎。因此，在低滲細胞混勻時，吹打動作要輕柔。

③ 固定是得到良好分散的染色體分裂相的重要步驟，考慮到基礎(chǔ)實驗課時間較短，故采用分步多次固定的辦法。

④ 滴片時使用的載玻片一定要非常干凈，此外，滴片的距離、滴加量多少也會影染色體分散的效果。

(2) 原位雜交注意事項：

① 變性的時間和溫度是雜交是否成功的關(guān)鍵，為了保證變性期間溫度的穩(wěn)定，變性時可以使用PCR儀或干式恒溫器；

② 變性結(jié)束，要立即甩掉蓋玻片并放入70%的冰乙醇中脫水，以免DNA復(fù)性，探針結(jié)合效率降低；

③ 雜交過程應(yīng)保持染色體標(biāo)本的濕潤，可以在飯盒內(nèi)鋪一層濕潤的濾紙做成濕盒，然后在濕盒中避光進行雜交；

④ 在使用熒光顯微鏡進行觀察時，應(yīng)盡快找到合適的分裂相并進行圖像采集，防止在長時間強光照射下熒光的萃滅。

5 討論

5.1 課時安排

基礎(chǔ)實驗課最突出的特點是每次上課的時間有限，一般情況下，每次實驗課的時間為4～5課時。因此，該實驗需要分兩次課完成。第1次課完成染色體標(biāo)本的制備，第2次課完成原位雜交。如果課時緊張，可由教師制作染色體標(biāo)本，學(xué)生只完成原位雜交的實驗內(nèi)容。

在實驗材料的選擇上也可以根據(jù)具體情況靈活決定，如果考慮到植物染色體標(biāo)本制備的難度較大，可以只選擇動物細胞作為實驗材料。在細胞類型的選擇上，可以選擇生長較快、中期染色體形態(tài)典型的細胞系，一方面可以縮短細胞培養(yǎng)的時間，另一方面有利于學(xué)生觀察學(xué)習(xí)。

5.2 教學(xué)組織

同綜合性、開放性實驗相比，基礎(chǔ)實驗課有諸多自己的特點。如基礎(chǔ)性實驗學(xué)生人數(shù)較多、強調(diào)單人操作、注重對學(xué)生基本實驗技能的訓(xùn)練等。因此，需要在教學(xué)的組織上大膽創(chuàng)新。例如，本實驗中，熒光顯微鏡使用的訓(xùn)練是主要目的之一，但熒光顯微鏡價格昂貴，不可能大批量配備，在授課課程中，可以將學(xué)生分為若干小組，每個小組在0.5～1.5 h的范圍內(nèi)采用不同的雜交孵育時間，就可以將學(xué)生使用熒光顯微鏡的時間分散開，避免因儀器數(shù)量不足給教學(xué)帶來影響。

6 結(jié)束語

將科研過程中常用的實驗技術(shù)轉(zhuǎn)化為適合本科生基礎(chǔ)實驗課教學(xué)的實驗內(nèi)容是實驗課教學(xué)改革的一個重要方向。熒光原位雜交技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域研究的各個方面，將其轉(zhuǎn)化為合適本科生基礎(chǔ)實驗教學(xué)的內(nèi)容，對擴展學(xué)生的創(chuàng)新思維、提高學(xué)生的科研能力都有重要的意義[12-13]。

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