何媛媛,于 哲,王海英,黃麗麗,王 惠

(西北農(nóng)林科技大學(xué) a 理學(xué)院，b 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，c 植物保護學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

1 材料與方法

1.1 材 料

供試菌種：蘋果樹腐爛病菌(Valsamalivar.mali)野生型菌株03-8、致病力增強突變體X907(由03-8經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化獲得)、致病力喪失突變體T1(由03-8經(jīng)PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化獲得)，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物病害綜合治理實驗室提供。

試劑：果膠(Pectin)、D-半乳糖醛酸為Sigma公司提供的分析純試劑；葡萄糖、麥芽糖、根皮苷、果膠、可溶性淀粉、硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、L-天門冬酰胺、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、Fe(NO3)3·H2O、MnSO4·5H2O、生物素(VH)、VB1、NaOH、C4H4KNaO6·4H2O、無水亞硫酸鈉、3，5-二硝基水楊酸(DNS)，均為國產(chǎn)分析純試劑。

Spectrum 756PC紫外分光光度計，由上海光譜儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 試劑的配制

DNS試劑 (3 g/L)：稱取3.0 g 3,5-二硝基水楊酸，溶解于500 mL蒸餾水中，再逐步加入10.4 g NaOH、90.0 g C4H4KNaO6·4H2O、2.5 g苯酚和2.5 g無水亞硫酸鈉，溫水浴(不超過48 ℃)中不斷攪拌，直至溶液清澈透明。冷卻后用蒸餾水定容至1 000 mL，保存于棕色瓶中。

pH 4.8檸檬酸緩沖液：取0.2 mol/L的Na2HPO4-2H2O溶液493 mL，加入0.1 mol/L檸檬酸溶液507 mL，即得1 000 mL的pH 4.8檸檬酸緩沖液。

果膠底物(5 g/L)：稱取0.5 g果膠，用pH 4.8檸檬酸緩沖液溶解，充分攪拌后，用緩沖液定容至100 mL，置于2～5 ℃冰箱內(nèi)冷藏。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MS液體培養(yǎng)基)參考Okuno等[11]的方法配制。每1 000 mL培養(yǎng)基含可溶性淀粉10 g，L-天門冬酰胺2 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，ZnSO4·7H2O 0.88 g，F(xiàn)e(NO3)3·H2O 1.5 mg，MnSO4·5H2O 0.44 mg，生物素(VH)5 μg，VB10.1 mg。

1.3 方 法

1.3.1 不同致病力的蘋果樹腐爛病菌胞外果膠酶活性的測定 將菌株03-8、X907和T1分別在PDA平板培養(yǎng)基上于25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d，用打孔器取直徑7 mm的菌餅7塊，放入200 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，25 ℃自然光照下靜置培養(yǎng)，每天人工振搖2次，設(shè)3個重復(fù)。分別在5，10，15和20 d于無菌條件下取5 mL培養(yǎng)液，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液即為粗酶液。用粗酶液進行果膠酶活性測定，探討3種菌株致病力與胞外果膠酶活性的關(guān)系。

通過物理斜面模型與巖質(zhì)邊坡受力分析，發(fā)現(xiàn)高中物理模型受力分析與巖質(zhì)邊坡受力特征非常相似；尤其是邊坡滑動時，物理斜面模型與巖質(zhì)邊坡受力特征一致，斜面摩擦力與巖質(zhì)邊坡下滑粘結(jié)力計算方法一致，所以巖質(zhì)邊坡受力特征可以用物理斜面模型代替；

1.3.2 不同碳源培養(yǎng)基中菌株03-8胞外果膠酶活性的測定 03-8菌株的培養(yǎng)、菌餅的采取及培養(yǎng)后菌液的采集和處理同1.3.1節(jié)，試驗所用培養(yǎng)基為以葡萄糖、麥芽糖、根皮苷、果膠、可溶性淀粉為碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(氮源為L-天門冬酰胺)。探討不同碳源對胞外果膠酶活性的影響。

1.3.3 不同氮源培養(yǎng)基中菌株03-8胞外果膠酶活性的測定 03-8菌株的培養(yǎng)、菌餅的采取及培養(yǎng)后菌液的采集和處理同1.3.1節(jié)，試驗所用培養(yǎng)基為以硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、L-天門冬酰胺為氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(以可溶性淀粉為碳源)。探討不同氮源與胞外果膠酶活性的關(guān)系。

1.3.4 果膠酶活性的測定 (1)D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。果膠酶活性的測定參考文獻[12]的方法。首先配制 2 mg/mL 的D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液100 mL，分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于10 mL具塞試管中，用蒸餾水補足到1 mL，然后再分別加入0.5 mL pH 4.8的檸檬酸緩沖液，再分別加入3.0 mL DNS試劑，沸水浴中反應(yīng)5 min，用流動水冷卻至室溫，用蒸餾水定容到10 mL。以D-半乳糖醛酸含量為0的試管為對照，測定其余各管在 540 nm波長下的吸光值(A540)。以A540為縱坐標(biāo)，D-半乳糖醛酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)果膠酶活性的測定。取1 mL粗酶液于試管中，在50 ℃水浴中平衡5 min，加入預(yù)平衡至50 ℃的果膠底物0.5 mL，50 ℃保溫30 min，加入3.0 mL DNS終止反應(yīng)后，沸水浴5 min，用流動水冷卻至室溫，最后加蒸餾水定容到10 mL,測定A540,以煮沸10 min滅活的粗酶液為對照。根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算D-半乳糖醛酸含量。酶活力單位(U)：1 mL酶在50 ℃、pH 4.8的條件下，1 h分解果膠產(chǎn)生1 mg D-半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，求得的回歸方程為：y=0.642x-0.037，R2=0.997。

2.2 不同致病力蘋果樹腐爛病菌胞外果膠酶活性的比較

3種蘋果樹腐爛病菌所產(chǎn)胞外果膠酶活性如圖2所示。

圖1 D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖2可以看出，3種蘋果樹腐爛病菌在不同發(fā)酵時間產(chǎn)生的胞外果膠酶活性明顯不同，但均在第10天達到最高。其中致病力增強的突變體X907發(fā)酵液中果膠酶活性，在任何時段均高于其他菌株，尤其在5～10 d內(nèi)果膠酶活性急劇增強。比較發(fā)酵第10天培養(yǎng)濾液中果膠酶的活性發(fā)現(xiàn)，03-8產(chǎn)生的果膠酶活性(1.436 U)明顯低于X907(2.482 U)，但高于致病力喪失突變體T1(1.165 U)，X907產(chǎn)生的酶活性是T1產(chǎn)生酶活的2.13倍。由此可以推測，蘋果樹腐爛病菌在發(fā)酵10 d時濾液中產(chǎn)生的胞外果膠酶活性與其致病力呈正相關(guān)關(guān)系。進一步推測，蘋果樹腐爛病菌分泌的胞外果膠酶可能是其致病力的重要因素。

2.3 不同碳源對菌株03-8產(chǎn)生的胞外果膠酶活性的影響

由圖3可以看出，在以葡萄糖、麥芽糖、根皮苷、果膠、可溶性淀粉為碳源時，培養(yǎng)濾液中03-8產(chǎn)生的胞外果膠酶活性均在第10天達最高值。就發(fā)酵第10天的胞外果膠酶活性而言，果膠、可溶性淀粉為最佳碳源，以葡萄糖、麥芽糖、根皮苷為碳源的培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生的胞外果膠酶活性均低于以果膠和可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基。表明復(fù)雜碳源(多糖)比簡單碳源(雙糖或單糖)更易于產(chǎn)酶。由于以果膠和可溶性淀粉為碳源時，胞外果膠酶活性沒有顯著性差異，從經(jīng)濟性考慮，宜選廉價易得的可溶性淀粉為碳源。

在以不同含量可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)03-8菌株，在第10天取樣檢測其胞外果膠酶活性，結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，可溶性淀粉含量為0.50%時胞外果膠酶活性最高。

圖3 不同碳源對蘋果樹腐爛病菌03-8株產(chǎn)生胞外果膠酶活性的影響

2.4 不同氮源對菌株03-8產(chǎn)生的胞外果膠酶活性的影響

由圖5可以看出，以蛋白胨為氮源時，整個培養(yǎng)過程中果膠酶的活性明顯高于其他氮源，其中以第10天果膠酶活性最高；以天門冬酰胺和牛肉膏為氮源時果膠酶活性仍以第10天最高；以酵母膏為氮源時，果膠酶活性與上述3種氮源變化趨勢不同，其在第20天時酶活性最高；以硫酸銨為氮源時，在整個培養(yǎng)過程中胞外果膠酶的活性變化不明顯。因此確定蛋白胨為最佳氮源。

以不同含量蛋白胨為氮源培養(yǎng)03-8菌株，在第10天對胞外果膠酶活性進行檢測，結(jié)果見圖6。由圖6可以看出，蛋白胨含量為0.25%時果膠酶活性最高。

綜合以上結(jié)果可以看出，以0.50%的可溶性淀粉為碳源，0.25%蛋白胨為氮源培養(yǎng)03-8菌株，第10天培養(yǎng)濾液中果膠酶活性最高。

3 討 論

3.1 蘋果腐爛病菌發(fā)酵產(chǎn)生的胞外果膠酶與其致病力的關(guān)系

本試驗以3種不同致病力的蘋果樹腐爛病菌03-8、X907和T1為材料，在相同的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，致病力與發(fā)酵第10天發(fā)酵液中胞外果膠酶的活性呈正相關(guān)。臧睿[4]發(fā)現(xiàn)，果膠酶與蘋果樹腐爛病的病疤擴展有關(guān)；韋潔玲等[13]研究發(fā)現(xiàn)，將蘋果腐爛病菌接入燙傷蘋果枝條10 d后，樹條發(fā)病明顯。結(jié)合本試驗結(jié)果分析可初步確定，蘋果腐爛病菌的致病過程與果膠酶的產(chǎn)生有直接關(guān)系。進一步推測，蘋果樹腐爛病菌的致病過程可能為在侵入的過程中產(chǎn)生果膠酶，待果膠酶活性達到最高時(10 d左右)，對寄主產(chǎn)生明顯損傷(降解果膠)，寄主表現(xiàn)出明顯病斑。

圖5 不同氮源對蘋果樹腐爛病菌03-8株產(chǎn)生的胞外果膠酶活性的影響

3.2 碳源對蘋果樹腐爛病菌產(chǎn)生的胞外果膠酶活性的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，以可溶性淀粉和果膠為碳源，蘋果樹腐爛病菌產(chǎn)生的果膠酶的活性高于以單糖或雙糖為碳源時的酶活，分析認為，蘋果樹腐爛病菌對多糖碳源的利用不是先水解后利用。Maldonada等[14]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖能夠抑制黑曲霉果膠酶的產(chǎn)生，本研究中將MS培養(yǎng)基的淀粉碳源換為葡萄糖時，產(chǎn)生的果膠酶活性下降，表明葡萄糖對蘋果樹腐爛病菌產(chǎn)胞外果膠酶也有一定的抑制作用。關(guān)于該菌對多糖碳源的利用機制還有待進一步研究。

3.3 氮源對蘋果樹腐爛病菌產(chǎn)生的胞外果膠酶活性的影響

本試驗發(fā)現(xiàn)，蘋果腐爛病菌產(chǎn)生胞外果膠酶活性受碳源影響相對較小，而受氮源影響相對較大。試驗中不同氮源在第10天時產(chǎn)生胞外果膠酶活性在0.48～2.06 U，比碳源改變時的酶活變化(1.08～2.02 U)幅度大。利用硫酸銨(無機氮源)作氮源時，發(fā)酵過程中胞外果膠酶的活性幾乎沒有變化，利用蛋白胨(有機氮源)作氮源時，發(fā)酵液酶活在第5～10天急劇增加，第10天其活性是以硫酸銨為氮源時的4.29倍。Baract-pereira[15]研究發(fā)現(xiàn)，酵母膏對青霉產(chǎn)果膠酶有促進作用，但酵母膏等有機氮源對黑盤菌產(chǎn)酶無影響，而無機氮中的硫酸銨和磷酸氫銨卻對黑盤菌產(chǎn)酶有促進作用。由此推測，不同菌對氮源的利用途徑可能不同，故在蘋果樹生長期間氮肥的使用需要謹慎。

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