董海波，王紹慶，賈媛媛，端木永前，陶詩煜，倪迎冬，張源淑，莊蘇，沈向真，趙茹茜

（南京農業(yè)大學 農業(yè)部動物生理生化重點開放實驗室，江蘇 南京210095）

亞急性瘤胃酸中毒的典型特征是攝食后瘤胃液pH在5.2～5.6之間并持續(xù)至少3h/d［1］。這種代謝紊亂的出現(xiàn)通常是由于動物攝入過量的可快速發(fā)酵的碳水化合物，而瘤胃不能及時中和其發(fā)酵產生的有機酸所致［2－4］。Fairfield等［5］研究表明約20%的商業(yè)化奶牛牧場中泌乳早期及中期奶牛瘤胃pH＜5.5，出現(xiàn)亞急性瘤胃酸中毒（SARA）狀態(tài)，導致牧場每頭牛每天損失約1.12美元，因此SARA已經(jīng)成為乳業(yè)的主要關注問題之一。增加奶牛能量攝食是緩解奶牛熱應激的重要措施，提高精料喂量，可在一定程度上增加能量攝入，提高養(yǎng)分消化率，改變氨基酸的代謝流向，緩解能量負平衡，但易引起奶牛代謝熱增加和瘤胃酸中毒［2，6］。然而，在生產中由于亞急性瘤胃酸中毒的診斷復雜性故不易被準確診斷出，目前主要以瘤胃液的pH變化作為主要的診斷依據(jù)［7－8］。嘗試一些其他組織的探索（如血液的代謝參數(shù)變化）從中找出相應的關鍵指標指示亞急性瘤胃酸中毒狀態(tài)也越來越被重視［9－10］。

有研究報道亞急性瘤胃酸中毒會導致乳產量下降，脂代謝和蛋白代謝發(fā)生變化特別是乳脂與乳蛋白含量的變化［4，11－12］。然而，目前有關SARA狀態(tài)時糖代謝的研究報道較少。動物機體負責能量代謝的主要器官和組織包括肝臟，肌肉以及脂肪組織。葡萄糖是動物機體重要的能源物質和代謝底物，主要通過食物攝取以及組織合成，如肝臟，肌肉等。肝臟是調節(jié)機體能量平衡尤其是糖、脂代謝的主要器官，對營養(yǎng)分配起著重要作用［13］，反芻動物肝臟是糖異生的主要場所［14］。肝臟中葡萄糖的轉運與葡萄糖轉運蛋白2（Glut2）的表達呈正相關，但Glut2的表達與各種激素的控制也密不可分［15］。肌肉是維持機體機動性與代謝健康的基本組織，其代謝穩(wěn)態(tài)在機體遭遇代謝應激時（包括飲食與鍛煉）會通過調控肌肉線粒體數(shù)量與功能以及葡萄糖代謝的變化以適應不同的應激［16］。肌肉中葡萄糖轉運蛋白4（Glut4）作為胰島素敏感性葡萄糖轉運載體可以減少外周血葡萄糖水平的上升［17］。有研究報道不同的動物或者人類肥胖模型均展現(xiàn)出脂肪組織中Glut4的表達下降，而不是肌肉［18］。此外，脂肪作為能量儲備的重要組織，在機體能量代謝不足時被分解供能，對機體的能量平衡起著重要作用，脂肪能值高，可以啟動能量代謝調節(jié)系統(tǒng)，有利于奶牛能量平衡［19］。本研究旨在模擬實際生產中的飼喂模式，通過長期飼喂高精料日糧，初步探索其對泌乳期反芻動物能量代謝的血液生化參數(shù)和相關基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

TRIzol?Reagent購自上海英俊生物技術有限公司；SYBR?Premix Ex TaqTM購自Takara公司；冷凍離心機（AllegraTM64R，BECKMAN COULTERTM，USA）；組織勻漿器；PCR儀（STRATAGENE，USA）；酶標儀（Synergy2，Biotek，USA）；NanoDrop TM1000sepctrophotometer（Thermo Scientific，USA）。

1.2 試驗動物與飼養(yǎng)

本實驗于2013年6月2日開始選用健康狀況良好，體重（47±8）kg的泌乳期山羊8只，手術安裝永久性瘤胃瘺管，恢復期為14d，隨機分成2組（4只/組）飼養(yǎng)于南京農業(yè)大學實驗動物房，單籠飼養(yǎng)，分別飼喂精粗比為40∶60和60∶40的日糧，自由飲水，每日飼喂時間為早08：00和晚18：00。

1.3 試驗設計

本試驗隨機分為2組，分別飼喂精粗比40∶60（LC）和60∶40（HC）日糧（由羊草、苜蓿草和精料組成），粗料由20%苜蓿草和80%羊草組成。2組日糧總能量和總蛋白含量相等。試驗期包括適應期2周和采樣期6周。飼料營養(yǎng)成分同以往研究報道［20］。

1.4 樣品采集處理與分析測定

1.4.1 瘤胃液采集和處理 實驗結束后分別于采食前0h，以及采食后1，2，3和5h通過瘤胃瘺管采集瘤胃液10mL（經(jīng)孔徑為0.15mm尼龍絹過濾），測定pH值。

1.4.2 肝臟，肌肉，脂肪的采集、RNA的提取及Real－time PCR 實驗結束將山羊宰殺后采集肝臟，肌肉，脂肪并迅速置于液氮中保存，待提取RNA。采用TRIzol一步法提取樣品總RNA，NanoDropTM1000分光光度法測定總RNA的濃度和純度，2%瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA質量，－70℃保存?zhèn)溆?。反轉錄酶體系及Tap酶為Promega產品，SYBR?購自TaKaRa公司。引物采用Primer 5.0軟件自行設計，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物列表見表1。

實時熒光定量分析采用2－ΔΔCT法，以內標基因β－actin為參照，計算目的基因轉錄的相對量，通過以下公式計算出每一個樣本的ΔΔCT值，最后每一個樣本值以2－ΔΔCT表示。X表示任意一個樣本，公式如下：

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 17.0軟件進行單變量雙因素分析，主效應分別為日糧處理和采樣時間；用ANOVA進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同精粗比日糧對瘤胃液pH的影響

雙因素（日糧效應與時間效應）分析結果顯示（圖1），日糧和采食后發(fā)酵時間顯著影響瘤胃液pH（P＜0.05）。高精料飼喂2周后，攝食后山羊瘤胃液pH低至5.2～5.8，持續(xù)時間超過3h（圖1A），符合瘤胃亞急性酸中毒的狀態(tài)，而LC組山羊瘤胃液pH處于正常變動范圍。然而，高精料飼喂8周后，瘤胃液pH升高，采食后瘤胃pH均高于6.0，但仍低于LC組山羊（圖1B）。

2.2 不同精粗比日糧對血液生化指標的影響

由表2顯示，與LC組相比較，HC組山羊血漿中谷草轉氨酶濃度有上升的趨勢（P＝0.09），血糖含量顯著升高（P＜0.05），血液中游離脂肪酸（NEFA）濃度有上升的趨勢（P＝0.071）（圖2），但血液中甘油三酯和膽固醇的含量無顯著變化。

表1 目的基因序列Table 1 The primer sequences of the target genes

圖1 不同精粗比日糧對瘤胃液pH的影響Fig.1 Effect of different concentrate ratio diets on rumen pH

2.3 糖代謝相關基因mRNA表達變化

如圖3所示，與LC組相比，HC組山羊肝臟中葡萄糖轉運蛋白Glut4mRNA表達有升高的趨勢（P＝0.06，圖3），肌肉中PCK2mRNA表達和脂肪組織中PC mRNA表達呈上升趨勢（P＝0.066，P＝0.069），其他糖代謝相關基因的表達未見顯著性變化（P＞0.05）。

表2 血液生化指標Table 2 The plasma biochemical index

圖2 不同精粗比日糧對血漿中非飽和脂肪酸（NEFA）的影響Fig.2 The effect of different concentrate ratio on NEFA of plasma

如圖4所示，在LC組中不同組織間Glut4，PC和PCK2基因的表達有差異。肝臟和肌肉組織相比，肌肉中Glut4mRNA表達豐度最高，達極顯著水平（P＜0.01）；而肝臟中PC和PCK2mRNA表達豐度極顯著高于肌肉和脂肪組織（P＜0.01），脂肪組織中PCK2表達量顯著高于肌肉組織（P＜0.05）。

3 討論

3.1 不同精粗比對瘤胃液pH及血液生化指標的影響

為了滿足泌乳的能量需求和提高泌乳性能，通常給泌乳反芻動物飼喂富含能量的高精料日糧；然而攝入過多的可快速發(fā)酵的碳水化合物易導致瘤胃中揮發(fā)性脂肪酸的沉積，以及異常代謝產物如脂多糖（LPS）和組胺的累積，從而導致泌乳早期和中期瘤胃亞急性瘤胃酸中毒［2，21－23］。本研究發(fā)現(xiàn)，給泌乳中期奶山羊飼喂60%精料日糧2周后，瘤胃液pH＜5.8并持續(xù)3h/d以上符合亞急性瘤胃酸中毒的界定范圍，與以往的研究結果相吻合［21，24］。然而，高精料飼喂8周后山羊采食后瘤胃液pH升高至6.0以上，但仍低于LC組山羊。以上結果提示瘤胃組織對長期飼喂高精料日糧出現(xiàn)適應現(xiàn)象［25］。此外，有文獻報道苜蓿（Medicagosativa）是高果膠（5%～10%）飼料，且富含鈣、鉀等堿性元素，具有較強的緩沖能力，果膠雖在瘤胃中降解快，但發(fā)酵產物是半乳糖醛酸，抑制了酸性乳酸菌的發(fā)酵，從而有助于瘤胃液pH值的穩(wěn)定［26］。

谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）是動物體內最為重要的2種轉氨酶，主要分布在肝臟、骨骼肌、腎臟、心肌等組織中，正常血清中含量低，但當上述組織細胞受損時，會導致酶活性升高［27］。本研究通過檢測血液生化指標發(fā)現(xiàn)，與LC組相比HC組山羊血液ALT無顯著變化，但是AST有上升的趨勢。這可能與機體為適應泌乳等生理需要，通過自身調節(jié)增強機體組織（如脂肪動員、蛋白動員等）代謝，導致AST活性增加有關［28］。此外，血液AST的增加也可能提示HC組山羊組織器官的損傷，如氧化應激損傷［29］。與LC組相比，HC組山羊血漿中NEFA有升高的趨勢，血漿葡萄糖的含量顯著升高。研究證明，血漿中NEFA的含量常被用于衡量機體能量狀態(tài)，NEFA升高提示動物機體能量暫時供應不足［30］，這可能是與長期飼喂高精料日糧導致食欲抑制有關［31］。當能量攝入不足時，為了改善營養(yǎng)缺乏，奶牛會動用體內儲備的脂肪和蛋白質滿足泌乳需要，如奶牛動用體脂滿足能量需要，動用體蛋白質分解為氨基酸去滿足肝糖異生［32］。葡萄糖作為乳糖合成的底物被乳腺攝取最終決定著奶產量的多少，而葡萄糖的主要來源則是肝臟糖異生。有研究報道，飼喂高精料日糧后引起反芻動物肝臟糖異生加強并伴隨血液中葡萄糖含量顯著上升［9－10］，與本研究結果相吻合。

圖3 不同精粗比日糧對不同組織中糖代謝相關基因mRNA表達的影響Fig.3 The effect of different concentrate diet on mRNA expression of glucose metabolic genes in different tissues

圖4 LC組中不同組織間糖代謝相關基因mRNA表達變化Fig.4 The effect of low concentrate diet on mRNA expression of glucose metabolic genes between different tissues in LC group

3.2 不同精粗比日糧對不同組織糖代謝相關基因表達的影響

肝臟對機體能量平衡起到重要作用，是糖酵解、糖原合成以及脂肪生成的重要位點［32］。特別是反芻動物，肝臟是提供乳糖合成所需葡萄糖來源的主要場所，占糖異生的80%［14，33］。本研究發(fā)現(xiàn)，長期飼喂高精料日糧后HC組肝臟中與糖分解或合成代謝相關的基因均未發(fā)生顯著變化，與葡萄糖轉運相關的蛋白Glut2基因表達也未發(fā)生變化，但胰島素敏感性葡萄糖轉運蛋白Glut4mRNA表達有上調趨勢。以往研究報道，葡萄糖轉運蛋白Glut家族中，Glut2主要分布在肝臟、腎以及胰腺β細胞；Glut4則主要分布在肌肉與脂肪組織中［34］，關于反芻動物肝臟中表達Glut4的報道甚少。本研究發(fā)現(xiàn)Glut4在肝臟中表達并有上升趨勢，說明Glut4也可能參與到肝臟糖異生及外周血液葡萄糖代謝變化。有研究指出肌肉中葡萄糖轉運蛋白4（Glut4）作為胰島素敏感性葡萄糖轉運載體可以減少外周血葡萄糖水平的上升，但肝臟中Glut4表達上升是否與血糖上升有關還不清楚，血糖的升高可能是機體能量代謝變化的綜合結果。此外，通過組織間比較發(fā)現(xiàn)，肌肉中Glut4mRNA表達最高，其表達豐度是肝臟的54倍，這與以往的研究報道相一致［15］。

泌乳期尤其是泌乳早期的反芻動物，通常處于能量負平衡狀態(tài)，血液胰島素含量升高并出現(xiàn)肌肉與脂肪組織胰島素抵抗現(xiàn)象［14］。有研究報道，高水平胰島素有抑制糖異生的作用［34］。本研究發(fā)現(xiàn)，肌肉與脂肪中糖代謝的關鍵酶PCK2和PC的表達量均有上升的趨勢。PEPCK是糖異生的限速酶，有2個亞型即PCK1和PCK2分別位于胞漿和線粒體內［35］，PCK1較適合于以氨基酸為底物的糖異生，而PCK2則較適合于以乳酸為底物的糖異生［36］。本研究發(fā)現(xiàn)肌肉中PCK2基因表達有上升趨勢，提示以乳酸為底物的糖異生加強。肌肉乳酸的升高也可能會為肝臟提供更多糖異生所需的碳源［14］。PC是糖異生的另一個關鍵酶，與PEPCK一起直接控制代謝產物。泌乳期奶牛為了增加泌乳量需要通過增強PC的表達提高內源性葡萄糖的產生［14］。本研究結果提示，HC組山羊脂肪組織中PC基因表達上升可能是血糖升高的原因之一。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，肝臟PC及PCK2mRNA表達均顯著高于肌肉和脂肪組織，這可能與反芻動物肝臟的特殊功能有關。反芻動物肝臟是利用來自瘤胃液丙酸異生成葡萄糖的主要場所［14］。

4 結論

長期飼喂高精料日糧導致泌乳期山羊血液NEFA，AST和葡萄糖含量升高，以及肝臟、肌肉和脂肪組織中參與糖異生關鍵基因的表達上調，提示機體代謝紊亂及糖異生增強。

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