陳淑琴，王生榮

(甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州 730070)

甘肅省是全國馬鈴薯(Solanumtuberosum)主產(chǎn)區(qū)之一，省內(nèi)大部分地區(qū)適宜馬鈴薯種植，主要分布在甘肅中東部地區(qū)的大部分山地和張掖、武威等地海拔1700 m左右的沙性土壤地區(qū)[1-2]，隨著種植面積的不斷擴大，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)已經(jīng)發(fā)展成為甘肅省貧困地區(qū)群眾脫貧致富的一個主導產(chǎn)業(yè)。而近年來馬鈴薯真菌病害的普遍發(fā)生，已成為影響馬鈴薯產(chǎn)量與質(zhì)量的嚴重障礙。目前馬鈴薯生產(chǎn)中主要依靠化學農(nóng)藥來防治，但化學農(nóng)藥的長期頻繁使用已導致病菌抗藥性逐漸增強、環(huán)境污染日益嚴重[3]。而拮抗性微生物是生物農(nóng)藥的重要來源，其中放線菌是具有巨大應用價值的微生物類群，已有研究表明放線菌能產(chǎn)生許多重要生理活性物質(zhì)，如抗生素類物質(zhì)、植物生長促進物質(zhì)、植物生長抑制物質(zhì)以及具有新特性的酶類，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)藥新藥的篩選上顯示出廣闊的應用前景[4-9]。放線菌作為農(nóng)用抗生素的主要產(chǎn)生菌在植物病害的生物防治中占有重要的地位，是新醫(yī)藥、新農(nóng)藥和生物防治活菌制劑的源頭[10-13]，在目前10000多種微生物的生物制劑中，有50%以上是放線菌產(chǎn)生的[14-16]，應用放線菌的生物資源有著巨大的社會效益和生態(tài)效益。

近年來，利用拮抗微生物尤其是真菌、細菌及其代謝產(chǎn)物控制植物病害已有一些報道[10]，但利用放線菌及其代謝產(chǎn)物抑制的報道還不多見。本文采用平板對峙法等對分離自馬鈴薯田的放線菌菌株D01對馬鈴薯4種病原真菌皿內(nèi)抑菌效果進行了測定，目的是為馬鈴薯真菌性病害生物防治提供新的途徑和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試靶標病原菌,馬鈴薯干腐病菌(Fusariumspp.)、馬鈴薯黑痣病菌(Rhizoctoniasolani)、馬鈴薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)、馬鈴薯早疫病菌(Alternariasolani)，均由甘肅農(nóng)業(yè)大學植物病理學實驗室2012年4月到2012年8月分離得到。

放線菌D01的來源,分離自甘肅省主要馬鈴薯種植區(qū)土壤樣品(2012年6月采自甘肅省定西市隴西縣鞏昌)，經(jīng)過初步生理生化測定并測序鑒定(另文發(fā)表)，編號為D01。

培養(yǎng)基,①PDA培養(yǎng)基，②高氏一號培養(yǎng)基，③液體發(fā)酵培養(yǎng)基：1%小米浸出汁1000 mL、葡萄糖10.0 g、蛋白胨3.0 g、NaCl 2.5 g、CaCO32.0 g、pH值7.2～7.4。

1.2 方法

1)供試病原菌及放線菌的活化培養(yǎng)

4種病原真菌進行活化培養(yǎng)，無菌條件下，將病原菌菌種接種在PDA平板培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)3～4 d，備用。將保存的放線菌D01在高氏一號培養(yǎng)基上進行劃線培養(yǎng)，28℃恒溫培養(yǎng)4 d，備用。

2)抑菌活性測定

①平板對峙法：在無菌操作條件下，倒PDA平板，冷卻，用直徑 6 mm的打孔器分別打病原菌和放線菌菌餅。將病原菌接種在PDA平板中間，28℃培養(yǎng)1 d后，然后在距離病原菌十字對稱25 mm處接種放線菌菌餅[17]，每處理3次重復，28℃恒溫培養(yǎng)4 d，觀察記錄對照菌落直徑與處理后靶標真菌菌落直徑，兩者之差為抑菌帶寬度。②放線菌的發(fā)酵培養(yǎng)：放線菌菌株D01在高氏一號平板培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4 d，按5%的量接種于250 mL三角瓶內(nèi)的50 mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，28℃，180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)7 d[18]。發(fā)酵液在4℃、10000 r/min離心20 min，上清液4℃儲存?zhèn)溆?。③抑制菌絲生長速率法：PDA培養(yǎng)基分裝滅菌，待冷卻到55℃時，將放線菌菌株發(fā)酵液與PDA培養(yǎng)基按1∶9的比例混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿中制成含發(fā)酵液培養(yǎng)基。培養(yǎng)基凝固后，在每個培養(yǎng)基平面接入靶標菌菌餅，將菌餅帶菌絲的一面貼在培養(yǎng)基表面，每處理3次重復。培養(yǎng)3～4 d后，用十字交叉法測定菌落直徑，計算抑菌率[19]。

抑菌率(%)=(1-處理供試菌菌落直徑/對照供試菌菌落直徑)×100%

3)受抑菌絲顯微觀察

在被抑制的菌落邊緣，挑取少量靶標真菌基內(nèi)菌絲，鏡檢觀察菌絲受抑制情況，并進行顯微照相。

4)受抑菌絲再生能力測定

從被抑制的菌落邊緣，挑取少量靶標真菌基內(nèi)菌絲接種于PDA平板上，以正?；鶅?nèi)菌絲為對照，28℃下培養(yǎng)，每24 h觀察菌落生長情況，測量并記錄菌落直徑，確定受抑制靶標真菌菌絲的再生能力[15-16]，每處理3次重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌D01對4種馬鈴薯病原真菌的抑制效果

采用平板對峙法、發(fā)酵液抑制菌絲生長速率法測定了放線菌D01對4種靶標真菌的抑菌作用，平板對峙培養(yǎng)結(jié)果(表1)表明，放線菌D01對4種靶標真菌均具有顯著的抑制作用，抑菌帶寬度均大于15 mm。生長速率法培養(yǎng)結(jié)果(表1)也表明，放線菌D01對馬鈴薯黑痣病菌、馬鈴薯早疫病菌表現(xiàn)出顯著的抑制作用，抑制率均大于80%，對馬鈴薯干腐病菌、馬鈴薯炭疽病菌也有較顯著的抑制效果，抑制率均在70%～75%之間?？傮w可以看出，放線菌對馬鈴薯的4種病菌表現(xiàn)出了穩(wěn)定的抑菌作用。

表1 放線菌D01對4種靶標真菌的皿內(nèi)抑制作用

2.2 受抑菌絲的形態(tài)變化

顯微觀察發(fā)現(xiàn)，受抑制靶標真菌的菌絲形態(tài)均發(fā)生了顯著的變化，但變化的細微處不同，放線菌作用于馬鈴薯黑痣病菌和馬鈴薯早疫病菌后，觀察到其基內(nèi)菌絲表現(xiàn)畸形，菌絲變粗，頂端變圓，隔膜增多等畸變現(xiàn)象(圖1)。而馬鈴薯干腐病菌和馬鈴薯炭疽病菌在受到放線菌抑制后，鏡檢可以發(fā)現(xiàn)其基內(nèi)菌絲的細胞壁被消解，原生質(zhì)濃縮，菌絲尖端膨大等(圖2)。由此可以看出，經(jīng)放線菌處理以后，靶標真菌的基內(nèi)菌絲發(fā)生了不同程度的畸變，而且會隨著處理時間的延長而程度加深。

2.3 受抑制菌絲的再生能力測定

測定靶標真菌受抑制的菌絲能否恢復生長能力，也就是放線菌對靶標真菌是否具有持續(xù)抑菌作用，結(jié)果表明，被抑制的馬鈴薯干腐病菌和馬鈴薯早疫病菌菌絲在正常條件下仍然可以恢復生長，但生長速率緩慢，菌落比對照稀疏，日生長量遠低于對照(圖3，圖4)；馬鈴薯炭疽病菌受D01抑制后，被抑制的菌絲在48 h后才緩慢恢復生長，但生長量小，且菌落顏色加深(圖5)；馬鈴薯黑痣病菌受D01抑制后，受抑制的菌絲在正常條件下生長明顯緩慢，24 h內(nèi)生長量為零，此后逐漸緩慢恢復生長(圖6)。放線菌D01對馬鈴薯的4種病原真菌不同程度的表現(xiàn)了持續(xù)抑菌作用。

圖1 放線菌D01對馬鈴薯黑痣病菌的作用Fig.1 Inhibiting effects on R. solaniA.CK菌絲體Normal mycelium; B.抑制后的菌絲體Inhibiting mycelium; C.CK; D.皿內(nèi)拮抗作用Antifungal activity in petri dishes.

圖2 放線菌D01對馬鈴薯干腐病菌的作用Fig.2 Inhibiting effects on Fusarium spp.A.CK菌絲體Normal mycelium; B.抑制后的菌絲體Inhibiting mycelium; C.CK; D.皿內(nèi)拮抗作用Antifungal activity in petri dishes.

圖3 干腐病菌受抑制后菌絲再生能力的變化Fig.3 Growth of mycelium of Fusarium spp.

圖4 早疫病菌受抑制后菌絲再生能力的變化Fig.4 Growth of mycelium of A. solani

圖5 炭疽病菌受抑制后菌絲再生能力的變化Fig.5 Growth of mycelium of C. coccodes

圖6 黑痣病菌受抑制后菌絲再生能力的變化Fig.6 Growth of mycelium of R. solani

3 結(jié)論與討論

1)平板對峙法和生長速率法的結(jié)果表明，放線菌D01對4種馬鈴薯病原菌均有較強的抑制作用，其中放線菌D01對馬鈴薯黑痣病菌和馬鈴薯早疫病菌表現(xiàn)出了顯著的抑菌效果，抑菌帶較寬，均大于20.0 mm，發(fā)酵液提取物的抑菌率也都大于80%；而對馬鈴薯炭疽病菌和馬鈴薯干腐病菌也有較顯著的抑制作用，拮抗帶寬度也都在15.0～20.0 mm，發(fā)酵液提取物的抑菌率也都在70%～75%。

2)受抑制菌絲的顯微觀察和再生能力的測定結(jié)果表明，放線菌D01對4種馬鈴薯病原真菌均表現(xiàn)出較顯著的持續(xù)作用，對受抑制菌絲觀察也發(fā)現(xiàn)，放線菌可能產(chǎn)生或者分泌了某種物質(zhì)，使得靶標真菌的菌絲發(fā)生畸變，從而達到對靶標真菌的持續(xù)抑制效果。放線菌可能合成了多種抗生素，干擾了病原菌的代謝作用，影響病原菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)；或者分泌了某種細胞壁降解酶類或有毒的次生代謝產(chǎn)物，導致細胞破裂，菌絲尖端幾丁質(zhì)呈裸露狀態(tài)，生長受阻，從而抑制病原菌的發(fā)生發(fā)展。

目前，對放線菌作用于植物病害防治的研究已經(jīng)取得了很大進展，但應用的過程中還存在一些問題。諸如有很多放線菌在實驗室中生防效果良好，但在大田試驗中不盡人意；放線菌活菌制劑在田間的不穩(wěn)定性；部分放線菌抗菌譜較窄，應用價值也比較低等等。分子生物學、遺傳學等多種手段的應用，將會進一步明確放線菌的生防機制，進行菌種改良與高效篩選，使其更好地投入到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中。