王紹飛，黃琳凱，張新全，馬嘯

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，四川 雅安625014）

多花黑麥草（Loliummultiflorum）因具有產(chǎn)量高、適應(yīng)性強、營養(yǎng)價值豐富等優(yōu)點，在我國南方地區(qū)糧草輪作中發(fā)揮了極其重要的作用，是南方地區(qū)推廣面積最大的栽培牧草之一［1－4］。我國多花黑麥草育種工作起步晚，育成品種較少，實際生產(chǎn)過程中多使用引進品種［5］，主推品種遺傳背景狹窄，因此怎樣加快育種步伐，育成一批適應(yīng)我國不同生態(tài)區(qū)實際生產(chǎn)需要的新品種成為亟待解決的問題之一［6］。近年來，越來越多的育種者采用標記輔助選擇（marker assisted selection，MAS）的方法，從分子標記的角度評價育種材料，避免環(huán)境等外界因素的影響，期望加快育種周期［7－13］。

目前，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)將DNA分子標記技術(shù)應(yīng)用在了多花黑麥草等牧草育種工作中。如Inoue和Gao［14］利用RFLP、AFLP、TASs（端粒重復(fù)相關(guān)序列）標記對多花黑麥草構(gòu)建高密度連鎖圖。Eduardo和Caroline［15］（2004）利用RAPD技術(shù)對來自巴西及烏拉圭的4個多花黑麥草群體做了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)來自不同地區(qū)的多花黑麥草群體間差異不明顯。季楊等［16］（2008）采用SRAP分子標記技術(shù)對多花黑麥草12個雜交組合的親本與后代共70個材料進行研究，通過分析雜種與雙親之間的擴增譜帶多態(tài)性，鑒別真假雜種。楊文軒等［17］（2010）利用SSR、SRAP標記對6個多花黑麥草親本品種及其9個雜交F2代組合80份材料進行遺傳分析，揭示了親本與其雜交后代間的遺傳關(guān)系。

材料間雜交是植物育種的基本手段之一，但多花黑麥草屬于異花授粉植物，不能采用系譜法進行育種，在形成雜交基礎(chǔ)群體之后一般進行混合選擇。在國內(nèi)外研究中，鮮見多花黑麥草群體改良效果及其群體內(nèi)、群體間的遺傳變異的分子標記評價的報道。本研究以2個多花黑麥草雜交世代材料及其親本為試驗材料，利用多花黑麥草基因組SSR標記從分子水平分析混合選擇對多花黑麥草雜交群體遺傳多樣性的影響，并評價各輪群體的遺傳變異情況，以期為已有的雜交后代群體的進一步遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗的供試材料包括2個多花黑麥草雜交組合［劍寶（♀）×長江2號（♂）、長江2號（♀）×劍寶（♂）］的各混合選擇改良后代群體及其親本共12份材料的360個單株（表1）。2008年5月，用人工去雄授粉的方法，將國審主推品種“長江2號”（四倍體）與國外引進品種“劍寶”（四倍體）選擇多個優(yōu)異單株進行正反雜交，2個雜交組合分別混收后代群體種子，然后每年對各雜交子代群體進行混合選擇，選擇目標是植株高大、分蘗多、葉片寬大、冬季生長速度快等，到目前為止，共進行了5輪（代）混合選擇。

表1 供試材料信息Table 1 The information of the tested materials

1.2 DNA提取及檢測

2013年2月參試的12份多花黑麥草材料，每份材料隨機選取30個健康單株，用其嫩葉按照CTAB法提取其單株基因組DNA。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計檢測DNA的純度及濃度，符合實驗要求的DNA存放于－20℃冰箱備用。純度及濃度不符合要求的，重新提取DNA。

1.3 SSR－PCR反應(yīng)及電泳檢測

SSR－PCR反應(yīng)擴增體系為15μL，包括：DNA 1μL（10ng/μL）、PCR－Mix 7.5μL（北京天根生化供試），正、反向引物各0.4μL（10pmol/μL），Taq DNA聚合酶0.3μL（2.5U/μL），ddH2O補足體積。反應(yīng)程序采用touchdown PCR：94℃預(yù)變性5min；10個降落循環(huán)：94℃變性30s，65℃開始每個循環(huán)降低0.5℃復(fù)性45s，直至60℃、72℃延伸1min；94℃變性30s，60℃復(fù)性45s、72℃延伸1min，共計30個循環(huán)；72℃延伸7min；10℃保存。引物采用最新開發(fā)的多花黑麥草基因組SSR引物［18］。

擴增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上檢測，先用200V恒定電壓預(yù)電泳30min，再在樣孔中每個樣品點樣6～8 μL，以50bp ladder為分子量標準，并用400V電壓電泳2h，參照許紹斌等［19］的方法銀染。電泳檢測重復(fù)2次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

由于供試材料均為同源四倍體，利用SSR標記難以辨別雜合基因型，故本研究將SSR標記不進行基因型判定，按照如下方法處理：按點樣順序?qū)Σ煌琒SR引物擴增分子量范圍內(nèi)的多態(tài)性條帶逐條記錄，對相同分子量的條帶按有無分別賦值，有帶記為1，無帶記為0，構(gòu)成二元數(shù)據(jù)矩陣。統(tǒng)計擴增產(chǎn)物的條帶總數(shù)（total No.of bands，TNB）和多態(tài)性條帶數(shù)量（No.of polymorphic bands，NPB），計算多態(tài)性百分率（percentage of polymorphic bands，PPB）。利用POPGENE軟件計算各群體的Shannon多樣性指數(shù)及Nei’s基因多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物的篩選及其多態(tài)性分析

從100對SSR引物中篩選出來20對條帶清晰、多態(tài)性好的引物（表2），對試驗材料進行PCR擴增，共得到217條清晰可辨條帶，平均每對引物擴增出的條帶數(shù)為10.9條；其中多態(tài)性條帶共有202條，平均每對引物擴增出10.1條多態(tài)性條帶，引物的平均多態(tài)性條帶百分率達到92.2%。表明這20對SSR引物具有較高的檢測效率。

表2 用于多花黑麥草SSR分析的引物序列和多態(tài)性Table 2 Primer sequences and amplification results from SSR analyses of L.multiflorum

2.2 各雜交后代群體的SSR擴增條帶分析

通過條帶類型統(tǒng)計，對各參試多花黑麥草材料條帶類型做劃分，計算各類型條帶數(shù)在總條帶數(shù)中所占的比重，可以分析各雜交世代材料在條帶類型上的變化。如表3所示，具有該類型條帶的記為“＋”，不具有該類型條帶的記為“－”，當某條帶在群體中出現(xiàn)頻率高于70%時可看作該群體的共有條帶。條帶類型被劃為7類。Ⅰ類：條帶在父本、母本、子代中都出現(xiàn)；Ⅱ類：條帶在雙親中均出現(xiàn)，而子代中沒有出現(xiàn)；Ⅲ類：條帶在父本及子代中出現(xiàn)，而母本沒有出現(xiàn)；Ⅳ類：條帶僅在父本中出現(xiàn)，而母本和子代中均沒有出現(xiàn)；Ⅴ類：條帶在母本及子代中出現(xiàn)，而父本中沒有出現(xiàn)；Ⅵ類：條帶僅在母本中出現(xiàn)，而父本和子代中均沒有出現(xiàn)；Ⅶ類：條帶僅在子代中出現(xiàn)，而父母本中均沒有出現(xiàn)。

從條帶類型占條帶總數(shù)百分比看，各群體均具有上述7種條帶類型（圖1，圖2）。Ⅰ類條帶反映雙親對后代的遺傳貢獻，它在各類型條帶中的比例最大，約占30.5%～38.6%，雜交世代組合“劍寶（♀）×長江2號（♂）”中，C3（F1）＞C4（F2），C4（F2）＜C5（F3）＜C6（F4）＜C7（F5）；雜交世代組合“長江2號（♀）×劍寶（♂）”中，C8（F1）＞C9（F2），C9（F2）＜C10（F3）＜C11（F4）＜C12（F5）。2個組合中均表現(xiàn)出F2＜F1＜F3＜F4＜F5的規(guī)律。Ⅱ類條帶占條帶總數(shù)的百分比可以反映子代對雙親條帶的缺失情況：雜交世代組合“劍寶（♀）×長江2號（♂）”中，C4（F2）＞C3（F1）＞C5（F3）＞C6（F4）＞C7（F5），而雜交世代組合“長江2號（♀）×劍寶（♂）”各群體間擁有相同的規(guī)律。Ⅰ、Ⅱ類條帶類型的統(tǒng)計規(guī)律表明各雜交世代群體中F2代出現(xiàn)最大的遺傳分離，從F3代起各世代材料繼承雙親遺傳背景的比例越來越高，而產(chǎn)生的新的遺傳變異越來越少。Ⅲ類條帶與Ⅴ類條帶的總數(shù)表示子代具有父本或者母本一方的特征帶總數(shù)。Ⅳ類條帶與Ⅵ類條帶的總數(shù)表示子代同時缺失父本和母本的特異性條帶總數(shù)。從統(tǒng)計結(jié)果看，相對于F1及F2代，F(xiàn)3、F4及F5代繼承父本或母本一方的特異性條帶的比例呈現(xiàn)逐步減少的趨勢，而同時缺失父本和母本特異性條帶的比例也在逐漸減少，說明F3、F4及F5代更多的繼承了父母本的分子特性，出現(xiàn)較少的遺傳變異。而Ⅶ類條帶表示子代特有的條帶，各世代材料表現(xiàn)出F1＞F2，F(xiàn)2＜F3＜F4＜F5的規(guī)律，表明雜交子代具有的特異性條帶數(shù)有增多的趨勢。

圖1 SSR引物L(fēng)MgSSR01－05F的擴增電泳圖Fig.1 SSR amplified results with primer pair LMgSSR01－05F

圖2 SSR引物L(fēng)MgSSR02－05E的擴增電泳圖Fig.2 SSR amplified results with primer pair LMgSSR02－05E

表3 雜交組合“劍寶（♀）×長江2號（♂）”和“長江2號（♀）×劍寶（♂）”各世代條帶類型統(tǒng)計Table 3 The band types of cross combination“Jumbo（♀）×Changjiang No.2（♂）”and“Changjiang No.2（♀）×Jumbo（♂）”

2.3 不同雜交世代群體間的遺傳變異比較

多態(tài)性條帶百分率（PP）、Shannon多樣性指數(shù)（I）和Nei’s基因多樣性（Ho）等都是能夠反映群體內(nèi)的遺傳多樣性豐富程度或群體變異程度的指標。對供試的多花黑麥草各群體進行多態(tài)性條帶統(tǒng)計（表4），發(fā)現(xiàn)20對具有多態(tài)性的SSR引物共擴增出217個條帶，其中多態(tài)性條帶比例為92.2%。雜交世代組合“劍寶（♀）×長江2號（♂）”的改良群體中，各世代群體的多態(tài)性條帶數(shù)出現(xiàn)先增后減的規(guī)律，表明遺傳變異在C4（F2）群體中達到最多之后依次減少。C3、C4群體的多態(tài)性條帶數(shù)高于兩親本C1、C2的多態(tài)性條帶數(shù)，雜交使多花黑麥草群體早代（F1、F2）的遺傳變異增多。雜交世代組合“長江2號（♀）×劍寶（♂）”的改良群體也表現(xiàn)出相同的規(guī)律。

表4 供試材料的遺傳多樣性分析Table 4 Genetic diversity indexes of tested materials

利用Popgene計算C1～C12各群體的I和Ho指數(shù)，進而計算群體平均遺傳多樣性指數(shù)（Hpop）及總?cè)后w遺傳多樣性指數(shù)（Hsp），分析遺傳多樣性在群體內(nèi)和群體間的分布。結(jié)果表明，雜交世代組合“劍寶（♀）×長江2號（♂）”的各改良群體（C3～C7）中各群體世代的Shannon多樣性指數(shù)和Nei’s基因多態(tài)性總體是減小的，即改良群體內(nèi)的遺傳變異逐步降低。C3（F3）～C7（F5）群體的平均多樣性指數(shù)（Hpop）為1.382，總的群體遺傳多樣性指數(shù)（Hsp）為1.912，即遺傳多樣性72.3%分布在群體內(nèi)，27.7%分布在群體世代間，說明雜交組合“劍寶（♀）×長江2號（♂）”的各世代改良群體內(nèi)的遺傳多樣性遠大于各輪改良群體間的遺傳多樣性，這符合多花黑麥草異花授粉的繁育方式［20］。在雜交世代組合“長江2號（♀）×劍寶（♂）”中，各輪改良群體（C8～C12）也表現(xiàn)出隨著選擇世代的增加遺傳變異減少的情況，且有75.2%的遺傳多樣性存在于群體內(nèi)，24.8%的遺傳多樣性存在于群體間。

3 討論與結(jié)論

本研究利用SSR分子標記對混合選擇下的2個多花黑麥草雜交后代5輪改良群體的遺傳變異進行分析。從條帶類型的變化上看，多花黑麥草雜交群體隨著混合選擇的進行，SSR引物擴增出來的與父母本共有的非特異性條帶數(shù)增多，缺失親本特異性條帶數(shù)減少，即群體的遺傳變異減少。遺傳多樣性參數(shù)也表現(xiàn)出同樣的趨勢，各改良群體的遺傳多樣性指數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)及多態(tài)性條帶百分率等都隨著選擇的不斷進行呈現(xiàn)出減小。關(guān)于供試多花黑麥草群體內(nèi)遺傳變異隨選擇世代的增加而下降的原因，這可能是連續(xù)對多花黑麥草株高、葉寬等性狀定向選擇導(dǎo)致遺傳漂變產(chǎn)生新的育種群體的結(jié)果［21］。此外在條帶類型分析中發(fā)現(xiàn)，雜交子代有缺失雙親共有條帶（Ⅱ類條帶）及出現(xiàn)非雙親條帶（Ⅶ類條帶）的情況。若親本的基因型雜合，子代可能會出現(xiàn)雙隱性基因型，再經(jīng)過人工選擇就會出現(xiàn)Ⅱ類缺少條帶。雜交中子代的DNA序列也可能會出現(xiàn)非孟德爾式的變異，子代DNA序列中可能出現(xiàn)非親本序列，從而有了Ⅶ類條帶。國內(nèi)外研究中已有同類報道，存在雜交子代缺失親本序列和出現(xiàn)非親本序列的現(xiàn)象［22－23］。

多花黑麥草通過雜交可以使其早代（F1、F2）的遺傳多樣性增加，但是隨著選擇的進行，群體內(nèi)個體間的遺傳多樣性會因連續(xù)對性狀的定向選擇以及因群體數(shù)量和選擇強度加大所引起的遺傳漂變而出現(xiàn)下降趨勢。因此，在多花黑麥草雜交育種過程中，應(yīng)盡可能擴大群體規(guī)模，增加有效群體的含量或增加新的優(yōu)良外源種質(zhì)，并適當降低選擇強度，來減小遺傳漂移，以保持育種群體的遺傳多樣性。同時，繼續(xù)保持適度選擇壓力，對F6等世代繼續(xù)檢驗其與親本和各雜交世代群體內(nèi)多樣性的差異性，還應(yīng)從表型和具有群體診斷性的高頻率穩(wěn)定條帶上來檢驗新群體與原始親本群體的差異，為新品種選育提供直接證據(jù)。

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