毛遠(yuǎn)麗，秦建成，李波

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在感染性疾病病原及耐藥檢測中的應(yīng)用

毛遠(yuǎn)麗，秦建成，李波

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)作為蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，具有高通量、高敏感度、操作簡單、快速獲得結(jié)果、可自建數(shù)據(jù)庫等特點(diǎn)。該技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病病原鑒定及耐藥檢測，對臨床感染患者的及時(shí)診治意義重大。本文通過介紹該技術(shù)對菌種、無菌部位等各類標(biāo)本的病原微生物進(jìn)行快速鑒定及耐藥檢測的研究現(xiàn)狀，探討其面臨的挑戰(zhàn)和應(yīng)用前景。

光譜法，質(zhì)量，基質(zhì)輔助激光解吸電離；細(xì)菌學(xué)技術(shù)；傳染病

自20世紀(jì)80年代初，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time of flightmass spectrometry,MALDI-TOFMS）就已成為一個(gè)用于研究與分析蛋白質(zhì)特征的有力工具。近年來各種科技的發(fā)展使其能夠?qū)怂?、蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子進(jìn)行微量分析。在疾病診斷與發(fā)生發(fā)展研究中，質(zhì)譜技術(shù)在生物標(biāo)志物的發(fā)掘和鑒定[1-2]、病原微生物的鑒定和分型[3]、靶蛋白的組織定位[4]等方面都有了初步研究結(jié)果。在這些研究中,MALDI-TOF-MS針對細(xì)菌鑒定的研究和應(yīng)用報(bào)道最早[5-6]，并已率先應(yīng)用于感染性疾病病原體臨床分離菌株的鑒定與分型。該技術(shù)打破了傳統(tǒng)的繁瑣鑒定流程，大大縮短了檢測時(shí)間，降低了檢測成本。當(dāng)前MALDI-TOF-MS在感染性疾病細(xì)菌或病毒病原的診斷與應(yīng)用研究中的焦點(diǎn)在以下方面：①培養(yǎng)純菌落的鑒定；②無菌部位樣本中細(xì)菌的直接鑒定；③細(xì)菌耐藥性的檢測；④病毒的檢測。

1 MALDI-TOF-MS原理和特點(diǎn)

MALDI-TOF-MS儀器主要由兩部分組成，即基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源（matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI）和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（time of flight,TOF）。MALDI的原理是待檢樣品與基質(zhì)混合形成共結(jié)晶薄膜，利用激光作為能量來源照射結(jié)晶體，基質(zhì)將激光中吸收的能量傳遞給待檢樣本中的生物分子，發(fā)生生物分子電離形成離子。TOF的原理是離子在加速電場下獲得相同的動(dòng)能，電場作用下經(jīng)高壓加速、聚焦后進(jìn)入飛行時(shí)間檢測器，根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時(shí)間不同，以檢測到的離子峰強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，以離子質(zhì)荷比（m/z）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行質(zhì)量分析，形成質(zhì)量圖譜。通過與已建立的圖譜庫或相應(yīng)軟件分析進(jìn)行比較，確定出特異性指紋圖譜，完成待檢樣本中生物分子的區(qū)分和鑒定[7]。這些原理使MALDI-TOF-MS能完成多種成分（包括蛋白質(zhì)、脂類、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其他能被離子化的分子）的分析[3-4，8]，同時(shí)具有樣本制備方便、實(shí)驗(yàn)操作簡單、數(shù)據(jù)庫可不斷擴(kuò)展等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)樣本微量化、高通量檢測和結(jié)果自動(dòng)分析，檢測過程從上樣到結(jié)果報(bào)告可在數(shù)分鐘內(nèi)完成。

2 MALDI-TOF-MS在細(xì)菌感染性疾病病原及耐藥檢測中應(yīng)用

2.1 培養(yǎng)純菌落的鑒定MALDI-TOF-MS技術(shù)應(yīng)用最廣泛、最成熟的是鑒定臨床標(biāo)本分離培養(yǎng)的細(xì)菌純菌落。目前已有經(jīng)FDA和SFDA批準(zhǔn)的質(zhì)譜儀及相應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，可覆蓋包括革蘭陰性菌、革蘭陽性菌等臨床常見細(xì)菌以及真菌的不同菌屬及菌種。Benagli等[9]用MALDI-TOF-MS與Phoenix、API和16S rDNA序列分析方法對1019株菌進(jìn)行比較研究，證明加德納菌、屎腸球菌和糞腸球菌等與其他常規(guī)方法的鑒定一致率分別為97.4%、100%和100%，其結(jié)果與16SrDNA序列分析幾乎完全吻合。但是鶉雞腸球菌和鏈球菌屬的鑒定一致率較低，分別為44.4%和78.9%。國內(nèi)學(xué)者用MALDITOF-MS鑒定27個(gè)菌屬和73個(gè)菌種共計(jì)1665株革蘭陰性菌，在屬和種水平上與Vitek 2鑒定結(jié)果的符合率埃希菌屬為99%和99%，克雷伯菌屬為95%和90%，假單胞菌屬為94%和89%，沙雷菌屬為93%和88%，腸桿菌屬為93%和73%，并將細(xì)菌鑒定時(shí)間由16～18 h縮短到3～5min。而鑒定氣單胞菌、弧菌和沙門菌在種的水平結(jié)果不理想，符合率僅為37%、27%和0[10]。Seng等[11]用MALDI-TOFMS對1660株臨床分離菌株（包括45個(gè)菌屬和109個(gè)菌種，每種有1～347個(gè)不同的菌株）進(jìn)行檢測，并通過16S rRNA和rpoB基因測序確定。結(jié)果顯示，MALDI-TOF-MS的鑒定準(zhǔn)確率≥95%，其中屬的鑒定水平達(dá)95%，種的鑒定水平在84%以上。另外，已有成功建立宋內(nèi)志賀菌的質(zhì)譜庫并用于臨床菌株鑒定的研究報(bào)道[12]。MALDI-TOF-MS技術(shù)對有些微生物如鏈球菌屬和嗜麥芽窄食單胞菌的鑒定不盡人意，可能與細(xì)菌之間的親緣關(guān)系相近或特殊蛋白指紋圖譜峰的特征性不明顯有關(guān)，須要在實(shí)際臨床應(yīng)用中不斷探索[13-14]。

2.2 無菌部位和尿液樣本的直接檢測MALDITOF-MS用于鑒定細(xì)菌分離菌株顯著縮短了報(bào)告時(shí)間，為臨床重癥感染者的及時(shí)救治起到重要作用。如果實(shí)現(xiàn)用感染者無菌部位經(jīng)培養(yǎng)的樣本直接進(jìn)行細(xì)菌鑒定，可以進(jìn)一步縮短時(shí)間。早在2009年La Scola等[15]就嘗試?yán)肕ALDI-TOF-MS直接從陽性血培養(yǎng)樣本中鑒定病原微生物，但由于血液樣本中多種成分的影響未獲成功。Ferroni等[16]和Prod'hom等[17]對需氧和厭氧血培養(yǎng)陽性報(bào)警瓶進(jìn)行前處理，通過細(xì)胞溶解以及差速離心分離等步驟來分離細(xì)菌和宿主蛋白，在30min內(nèi)就可完成鑒定，在細(xì)菌種水平上的鑒定正確率達(dá)到75%～95%。Haigh等[18]分別用富集法和Sepsityper商品試劑盒對350個(gè)血培養(yǎng)陽性瓶樣本直接進(jìn)行處理，采用MALDI-TOFMS進(jìn)行快速鑒定。整個(gè)實(shí)驗(yàn)在30min內(nèi)均可完成，結(jié)果除53個(gè)混合性細(xì)菌未能鑒定外，總體正確率分別為74%和77%。其中，鑒定革蘭陰性菌的正確率分別為91%和88%，鑒定革蘭陽性菌的正確率分別為14%和36%，可能與該研究的菌種組成有關(guān)。Lee等[19]用MALDI-TOF-MS直接對尿液樣本鑒定腐生葡萄球菌，并與目前通用的鑒定系統(tǒng)包括BD公司的phoenix鑒定儀、梅里埃公司的Vitek 2鑒定儀和MicroScan鑒定系統(tǒng)比較。通過16s rRNA和rpoB基因測序確定，鑒定正確率分別為100%、86.7%、86.7%和93.3%。Ferreira等[20]用MALDI-TOF-MS聯(lián)合UF-1000I流式細(xì)胞儀直接對220例細(xì)菌含量大于105CFU/ml的尿路感染標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌鑒定，結(jié)果對最常引起尿路感染的大腸埃希菌在種水平上的鑒定正確率分別為91.8%和92.7%。多數(shù)研究結(jié)果表明，當(dāng)患者為單一菌感染和菌落計(jì)數(shù)達(dá)105CFU/ml時(shí)，MALDI-TOF-MS種屬鑒定準(zhǔn)確率可以達(dá)到90%以上，而對于混合性細(xì)菌感染尿液樣本的鑒定，其鑒定正確率會(huì)大大降低。盡管Nyvang Hartmeyer等[21]報(bào)道了用MALDI-TOF-MS在30min內(nèi)快速鑒定出1例患者腦脊液標(biāo)本中肺炎鏈球菌的結(jié)果，目前該技術(shù)對胸水、腹水、腦脊液、膿液等標(biāo)本的直接檢測的相關(guān)報(bào)道還比較少，應(yīng)用于這些無菌部位體液中病原的直接鑒定還有待于進(jìn)一步探索。

2.3 細(xì)菌耐藥性檢測MALDI-TOF-MS對耐藥細(xì)菌的檢測潛能正在被逐漸挖掘。多數(shù)研究采用以下方法：①尋找耐藥菌株與敏感菌株間的特征性蛋白和圖譜峰；②通過耐藥菌株與抗生素共培養(yǎng)，然后檢測分解產(chǎn)物。對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin-sensitive Staphylococcusaureus,MSSA）的檢測研究較多且較為成熟[22-23]。Edwards-Jones等[24]在對金黃色葡萄球菌的耐藥研究中發(fā)現(xiàn)，MRSA的質(zhì)譜圖中多個(gè)峰值（82～209）顯著高于MSSA（37～67）的峰值，且MRSA和MSSA都有各自的特征峰，MRSA菌株蛋白質(zhì)指紋圖譜特征峰主要位于500～2000m/z的小分子量范圍內(nèi)[22]。Majcherczyk等[23]研究顯示，MALDITOF-MS能夠區(qū)分基因型相同的不同耐藥性菌株，主要就是根據(jù)不同耐藥性菌株所具有不同的特征性圖譜。Wolters等[25]對MRSA中的青霉素結(jié)合蛋白PBP2a檢測的研究結(jié)果表明，通過尋找耐藥菌株的特征性蛋白也可以確定耐藥菌，如可迅速確認(rèn)金黃色葡萄球菌中甲氧西林耐藥表型。MALDI-TOF-MS用于檢測產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶和碳青霉烯酶的耐藥菌，通過耐藥菌株與酶抑制劑抗生素共培養(yǎng)1～3 h，產(chǎn)生足以被質(zhì)譜儀檢測到的酶切產(chǎn)物，然后檢測分解產(chǎn)物，從而間接證明耐藥酶的存在。采用此方法已成功檢測到對氨芐西林、哌拉西林、頭孢曲松和頭孢他啶耐藥的腸桿菌科細(xì)菌及產(chǎn)NDM-1、VIM-1、KPC、OXA-48和OXA-162型碳青霉烯酶的細(xì)菌[26-29]。

2.4 病毒感染的檢測常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室病毒主要是檢測病毒的特異性抗原、抗體或核酸片段，多采用ELISA、PCR等技術(shù)。質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展為病毒感染的快速診斷提供了新的選擇。目前多數(shù)研究通常采用PCR技術(shù)和MS技術(shù)相結(jié)合，通過對擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段進(jìn)行質(zhì)譜檢測，或通過比較酶切片段質(zhì)荷比的變化進(jìn)行分型，通常MALDI-TOF-MS可以分辨出5Da以下的質(zhì)量差異，而核酸之間的質(zhì)量差異通常在10Da以上，所以MALDI-TOF-MS對核酸的檢測比傳統(tǒng)的電泳技術(shù)靈敏度高。

Sj?holm等[30]采用MALDI-TOF-MS技術(shù)直接檢測血清和無菌體液等樣本中的多種皰疹病毒（包括單純皰疹病毒、帶狀皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、人類皰疹病毒6、7、8及皰疹病毒B型），與多重PCR檢測的一致性達(dá)95%；病毒含量在5～100 copies時(shí)的靈敏度達(dá)100%，特異度達(dá)92%～100%，特別適合于大規(guī)模流行病學(xué)研究及人群篩查。Chou等[31]的研究結(jié)果顯示，MALDI-TOF-MS技術(shù)用于檢測流感病毒也具有較好的準(zhǔn)確性及靈敏度。研究者將磁性納米粒子-抗體復(fù)合物與MALDI-TOF-MS技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行流感病毒H5N2的檢測，1 h內(nèi)完成，靈敏度達(dá)103EID50/ml。還有研究用MALDI-TOF-MS技術(shù)與多重PCR結(jié)合，同時(shí)檢測人類8種不同腸道病毒（包括戊型肝炎病毒、柯薩奇病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、星狀病毒、諾如病毒、?？虏《?、腸病毒71、呼腸病毒），在病毒含量為100～1000 copies時(shí)，診斷特異度達(dá)100%；對多重感染診斷具有很好的應(yīng)用價(jià)值[32]。Yi等[33]利用GP5+/GP6+引物擴(kuò)增L1基因區(qū)片與MALDI-TOF-MS技術(shù)結(jié)合，可鑒定14種高風(fēng)險(xiǎn)的人乳頭瘤病毒，靈敏度為10～100 copies/ml，24 h可完成4500個(gè)標(biāo)本檢測，并且與低風(fēng)險(xiǎn)HPV型無交叉反應(yīng)。該方法的另一個(gè)優(yōu)勢是可以通過增加引物種類而檢測新的型別，具有很好的臨床應(yīng)用前景和大范圍流行病學(xué)調(diào)查價(jià)值。

病毒變異是臨床抗病毒治療的棘手問題，目前已應(yīng)用MALDI-TOF-MS的核酸分析技術(shù)進(jìn)行HBV和HCV的血清分型，并可以檢測病毒的變異，區(qū)分野生株和突變株，指導(dǎo)臨床用藥。該方法具有快速及低成本的優(yōu)點(diǎn)，但缺點(diǎn)是只能用于HBV的 B和C型[34]。Hong等[35]采用MALDI-TOF-MS方法進(jìn)行HBV的YMDD變異位點(diǎn)的檢測，該方法具有更高的靈敏度和特異度，并且可以對HBV感染者抗病毒藥物治療效果進(jìn)行監(jiān)測。另外，MALDITOF-MS用于HCV分型及抗病毒藥物耐藥檢測的研究也有文獻(xiàn)報(bào)道[36-39]。

3 問題與對策

盡管質(zhì)譜技術(shù)在感染性疾病病原微生物鑒定的研究和應(yīng)用領(lǐng)域已取得了顯著成績，但在臨床應(yīng)用中還存在諸多須要研究和解決的問題，須要我們在應(yīng)用過程中不斷加以改進(jìn)和完善。首先，質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的資源不足、鑒定病原的種類受到數(shù)據(jù)庫的限制是制約質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于臨床的主要因素[40]。目前,各型號(hào)質(zhì)譜儀的數(shù)據(jù)庫資源都是有限的，如Bruker公司的MICROFLEXTM，UITRAFLEXⅡTM,AUTOFLEXTM和BIFLEXTM等型號(hào)的質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)庫中，擁有的芽孢桿菌屬和乳酸桿菌屬的數(shù)據(jù)比較龐大，但沙門菌卻僅有16個(gè)種，而且沒有志賀菌、布魯氏菌以及霍亂弧菌的相關(guān)數(shù)據(jù)及圖譜。Micromass公司的MALDI-Liner飛行時(shí)間質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)庫內(nèi)含有志賀菌的數(shù)據(jù)資源，但是芽孢桿菌屬的數(shù)據(jù)比較少。雖然質(zhì)譜儀器公司也先后推出了配套質(zhì)譜圖分析軟件（如BioTyper、Mascope等），但數(shù)據(jù)庫的及時(shí)更新與補(bǔ)充仍是一個(gè)難題。利用一定數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)菌株和已知臨床分離菌株補(bǔ)充和更新菌株數(shù)據(jù)庫，必要時(shí)可考慮對某些菌種建立本地區(qū)性的數(shù)據(jù)庫，甚至可以建立多地區(qū)數(shù)據(jù)庫聯(lián)網(wǎng)共享，以解決錯(cuò)誤鑒定、無法鑒定及低分鑒定等問題。第二，待檢樣本的處理方法沒有標(biāo)準(zhǔn)化是導(dǎo)致獲得的質(zhì)譜圖峰信息存在差異的主要因素之一。因此，針對不同種類的菌屬應(yīng)有不同的培養(yǎng)條件及檢測參數(shù)的設(shè)置，對于某些可直接檢測的樣本，應(yīng)選擇合適的預(yù)處理方法。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用Microflex-LT質(zhì)譜儀已完成各類細(xì)菌、真菌及分枝桿菌等近2萬多株臨床菌株的鑒定，在工作中積累了較多經(jīng)驗(yàn)。對于臨床分離菌株的樣本，菌種的純度、菌濃度、基質(zhì)液的選擇以及涂抹到載體的均勻度都會(huì)影響MALDI-TOF-MS對菌株的鑒定正確率。例如，黏液性的肺炎克雷伯菌經(jīng)常會(huì)有無法鑒定的結(jié)果，當(dāng)涂抹細(xì)菌時(shí)做到盡量薄、均一，就可以達(dá)到較好的鑒定結(jié)果。又如對于酵母菌、鏈球菌、棒狀桿菌等的鑒定，如果使用直接涂抹法，在靶板上涂抹菌液后加1μl70%的甲酸，然后再加基質(zhì)，可提高此類菌的鑒定率。對于血培養(yǎng)陽性瓶直接檢測的標(biāo)本，更應(yīng)對標(biāo)本采集、培養(yǎng)瓶基質(zhì)、樣本去紅細(xì)胞、蛋白沉淀、蛋白提取和溶出等樣本預(yù)處理的關(guān)鍵環(huán)節(jié)建立起規(guī)范化程序，并在實(shí)際工作中不斷完善。第三，MALDI-TOF-MS技術(shù)在細(xì)菌耐藥檢測的研究尚處起步階段，應(yīng)用于臨床還需要很多工作他方法進(jìn)行研究，包括建立不同耐藥機(jī)制的檢測方法和耐藥庫，以擴(kuò)展、完善、標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)譜技術(shù)在細(xì)菌耐藥方面的檢測。同時(shí)由于基因擴(kuò)增和序列分析技術(shù)用于病毒核酸、分型、變異以及耐藥檢測在臨床實(shí)驗(yàn)室已日趨成熟，使MALDI-TOFMS技術(shù)的應(yīng)用受到一定限制。第四，與細(xì)菌鑒定比較，采用MALDI-TOF-MS技術(shù)檢測病毒還存在一定的局限性。①M(fèi)ALDI-TOF-MS通常是檢測待檢樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增后的核酸片段，與細(xì)菌鑒定相比，采用質(zhì)譜檢測在時(shí)限性上沒有明顯的優(yōu)勢；②檢測的結(jié)果受PCR的影響，引物的設(shè)計(jì)要求比較高，尤其是高通量檢測多個(gè)病原；③質(zhì)譜檢測對樣本的純度要求很高，PCR體系中的離子會(huì)影響質(zhì)譜檢測的分辨率和信號(hào)強(qiáng)度，因此樣本須要進(jìn)行純化，這使得檢測的過程更加復(fù)雜[32，36]。

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（2014-08-26收稿 2014-09-12修回）

（責(zé)任編委 李 軍 本文編輯 王 姝）

The application of thematrix-assisted laser desorption ionization time of flightmass spectrometry in the infectious disease pathogens and drug resistance detection

MAO Yuan-li*,QIN Jian-cheng,LIBo
Clinical Laboratory Center,302 Hospital of PLA,Beijing 100039,China
*Corresponding author,E-mail:maoyuanlee@163.com

Matrix-assisted laser desorption ionization time of flightmass spectrometry（MALDI-TOF-MS）works as amethod for proteomics analysis with characteristics of high throughput,high sensitivity,simple operation,quick results and the self-built database.This technology has been applied in infectious disease pathogen identification and detection of drug resistance,and is of great significance to timely diagnosis and treatment.By introducing the research status of the technology in its quick identification and drug resistance detection of pathogenic microorganisms of such specimens as strains and sterile,this paper discusses its challenges and application prospects.

spectrometry,mass,matrix-assisted laser desorption ionization;bacteriological techniques;communicable diseases

R313

A

1007-8134(2014)05-0270-05

國家“十二五”科技重大專項(xiàng)（2012YQ180117）

100039北京，解放軍第三○二醫(yī)院臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心（毛遠(yuǎn)麗、秦建成、李波）

毛遠(yuǎn)麗,E-mail:maoyuanlee@163.com