林 聰,王振平,周 興,李文超,代紅軍
(寧夏大學(xué) a 葡萄與葡萄酒教育部工程研究中心,b 農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川 750021)
葡萄酒的質(zhì)量很大程度上取決于釀酒葡萄原料的品質(zhì)[1],而糖和酸含量是評價(jià)優(yōu)質(zhì)釀酒葡萄的基礎(chǔ)指標(biāo)。糖酸含量的高低決定著葡萄酒的酒度和風(fēng)味,此外色素、香氣和酚類物質(zhì)的形成也與糖有關(guān)。提高葡萄原料的品質(zhì)主要從品種自身內(nèi)在因素與外界壞境兩方面來著手,對于特定的釀酒葡萄品種,不易改變其內(nèi)在因素,但可以人為改變外界環(huán)境因子[2]。目前,已有很多有關(guān)外界環(huán)境對葡萄品質(zhì)影響的研究,但多集中在整形修剪[3-4]、疏花疏果減少負(fù)載量[5-8]、施肥改善土壤條件[8-11]以及應(yīng)用外源植物生長調(diào)節(jié)劑[12-13]來提高葡萄品質(zhì)等方面。生物活性水是一種新型循環(huán)農(nóng)業(yè)技術(shù)的產(chǎn)物,是采用“BMW”(Bacteria,Mineral,Water)技術(shù)處理畜禽糞便污水,利用自然界中的微生物、礦物質(zhì)及水創(chuàng)造出類似自然凈化系統(tǒng)的人工循環(huán)系統(tǒng),由此生產(chǎn)的含有多胺類物質(zhì)的液體[14-15]。據(jù)報(bào)道,日本早在20多年前就已有生物活性水,并直接為農(nóng)場企業(yè)或農(nóng)民采用,使用效果良好。在國內(nèi),也有少量關(guān)于生物活性水在農(nóng)作物上應(yīng)用的研究報(bào)道[16-17],但在果樹上的研究卻很少。為此,本研究采用田間試驗(yàn),通過測定葡萄果實(shí)可溶性糖、可滴定酸、色素、單寧等品質(zhì)指標(biāo)及糖代謝相關(guān)酶活性的變化,探討生物活性水對釀酒葡萄蛇龍珠果實(shí)品質(zhì)及糖酸積累規(guī)律的影響,以期為我國釀酒葡萄的栽培及葡萄酒品質(zhì)的研究提供理論依據(jù)。
1.1.1 葡萄品種及生物活性水 本試驗(yàn)于2012年在寧夏大學(xué)玉泉營葡萄基地(位于寧夏賀蘭山東麓地區(qū))和寧夏大學(xué)葡萄栽培生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,選取生長發(fā)育一致、無病蟲害的5年生歐亞種釀酒葡萄品種蛇龍珠(VitisviniferaL.cv.Cabernetgernischt)為試材,行距3.5 m,株距1 m,采用單臂籬架整枝,東西行向,常規(guī)管理。試驗(yàn)藥劑生物活性水原液為中日合作“糞尿無害化處理技術(shù)研究”項(xiàng)目的產(chǎn)品。
1.1.2 主要生化試劑 蒽酮、硫酸、福林-丹尼斯(F-D)、乙醇、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、水合碳酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、3,5-二硝基水楊酸(DNS)、間苯二酚、鹽酸、苯酚、無水亞硫酸鈉、酒石酸鉀鈉、檸檬酸、磷鉬酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、吐溫-20、牛血清蛋白和蔗糖,以上試劑均為分析純生化試劑。
試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理,即將生物活性水原液稀釋50(處理A)、100(處理B)、200(處理C)、400倍(處理D)用于葉面噴施,以清水處理為對照(CK),每個(gè)處理選30株,10株為1個(gè)小區(qū),設(shè)置3個(gè)重復(fù),隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。從花后30 d(即轉(zhuǎn)色期前半個(gè)月)開始,每隔7 d對葡萄進(jìn)行1次葉面噴施,共噴施3次。從08-08(即花后53 d)開始,每隔7 d采樣1次果實(shí)樣品,直至采收期結(jié)束,每次采樣時(shí)從各處理植株的上、中、下3個(gè)部位的5~6個(gè)果穗上采取大小均一的果實(shí),液氮速凍后用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室,貯于 -80 ℃冰箱中備用。
1.3.1 可溶性總糖、還原糖含量 總糖采用蒽酮-硫酸法[18]測定,還原糖采用DNS法[19]測定。
1.3.2 可滴定酸含量 采用酸堿滴定法[20]測定。
1.3.3 色素含量 參照楊夫臣等[21]改進(jìn)的方法。準(zhǔn)確稱取葡萄果實(shí)粉末0.5 g于離心管中,加入10 mL乙醇(體積分?jǐn)?shù)70%)與檸檬酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%)按體積比5∶1混合而成的提取液,于80 ℃恒溫水浴鍋中浸提90 min,接著迅速用冰水冷卻后,4 000 r/min離心15 min,沖洗1次,用原提取液定容到100 mL,用紫外分光光度計(jì)在530 nm處測定其吸光度。
1.3.4 單寧含量 采用福林-丹尼斯法[22]測定。
1.3.5 總酚含量 采用福林-肖卡法[22]測定。
1.3.6 蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性 取花后60~95 d的樣品,測定其蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性,其中可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶(Soluble acid invertase,SAI)、可溶性中性轉(zhuǎn)化酶(Soluble neutral invertase,SNI)活性的測定參照Lowell等[23]和Hubbard等[24]的方法進(jìn)行;細(xì)胞壁結(jié)合的酸性轉(zhuǎn)化酶(Cell wall-bound acid invertase,CBAI)活性的測定參照Miron等[25]的方法進(jìn)行。各指標(biāo)重復(fù)測定3次,結(jié)果取平均值。
采用Microsoft Excel 2003版、DPS v7.05版及SAS 8.1版軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析,并采用新復(fù)數(shù)極差法進(jìn)行差異性比較。
由表1可知,除稀釋400倍生物活性水噴葉處理葡萄果實(shí)的可溶性總糖含量略有降低外,其余生物活性水處理葡萄果實(shí)的可溶性總糖含量均較對照有所提高,但差異均不顯著;C處理可以極顯著降低總酸含量,D處理可以極顯著提高總酸含量;4個(gè)生物活性水處理均可以極顯著提高果實(shí)的色素含量;A、C、D處理可以極顯著提高葡萄皮的單寧含量,B、C、D處理可以極顯著提高葡萄籽的單寧含量;除D處理外,其余處理葡萄果實(shí)的糖酸比均有不同程度的升高;不同生物活性水處理均可以降低葡萄果實(shí)的總酚含量,但只有C處理有極顯著差異。A、B、C處理較對照而言,葡萄果實(shí)色素分別提高了48.53%,10.29%和7.35%,葡萄皮單寧含量分別提高了35.65%,23.04%和37.39%,葡萄籽單寧含量分別提高了0.33%,2.96%和27.26%;較對照而言,D處理葡萄果實(shí)可滴定酸含量提高了7.70%,色素提高了23.53%,葡萄皮單寧含量提高了39.13%,糖酸比降低了7.60%。總體來看,D處理可以有效提高葡萄果實(shí)的整體品質(zhì)。
表1 生物活性水對釀酒葡萄品質(zhì)的影響
生物活性水對葡萄果實(shí)發(fā)育過程中可溶性總糖積累的影響結(jié)果見圖1。
圖1 生物活性水對葡萄果實(shí)發(fā)育過程中可溶性總糖積累的影響
由圖1可知,在葡萄轉(zhuǎn)色早期,其果實(shí)的糖含量較低,在花后53~60 d時(shí),糖的積累很快;花后60~81 d,糖的積累趨緩,至花后81 d時(shí),糖的積累達(dá)到最高值;花后81~95 d,糖含量基本趨于穩(wěn)定。在生物活性水處理早期,A處理可以明顯地促進(jìn)糖的積累,隨著生物活性水稀釋倍數(shù)的增大,其對糖積累的促進(jìn)作用也隨之減小,其中C、D處理有降低糖含量的趨勢,在處理后期,A、B處理對糖含量的積累表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用。
在釀酒葡萄果實(shí)中,可溶性總糖的主要成分是還原糖。生物活性水對葡萄果實(shí)中可溶性還原糖積累的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知,低稀釋倍數(shù)的生物活性水處理可以提高葡萄果實(shí)可溶性還原糖含量,高稀釋倍數(shù)的生物活性水處理有降低葡萄果實(shí)可溶性還原糖含量的作用。在噴施生物活性水處理早期(即花后53~74 d),A、B處理可以提高可溶性還原糖含量,C處理有降低可溶性還原糖含量的作用,而在處理后期(即花后88~95 d),A、B、C處理均可以提高可溶性還原糖含量,且以B處理表現(xiàn)最為穩(wěn)定。
生物活性水對葡萄果實(shí)發(fā)育過程中可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶活性的影響結(jié)果見圖3。圖3表明,在葡萄果實(shí)發(fā)育進(jìn)入轉(zhuǎn)色期后,不同生物活性水處理的SAI活性的變化趨勢基本一致?;ê?0~74 d,不同處理的SAI活性均逐漸增加,在花后74 d達(dá)到高峰,之后SAI活性逐漸降低。CK處理的SAI活性在進(jìn)入轉(zhuǎn)色期后一直處于下降趨勢。在處理前期(花后60~67 d),A、B處理的SAI活性明顯高于對照(CK),在花后74~95 d,A、B、C、D處理的SAI活性均高于對照,且差異顯著。4個(gè)處理中,D處理的SAI活性在轉(zhuǎn)色期后的變化表現(xiàn)得相對較為穩(wěn)定。
圖2 生物活性水對葡萄果實(shí)發(fā)育過程中可溶性還原糖積累的影響
圖4表明,在葡萄果實(shí)發(fā)育進(jìn)入轉(zhuǎn)色期后,在不同處理?xiàng)l件下,葡萄果實(shí)的SNI活性變化趨勢基本一致。花后60~67 d,SNI活性顯著下降;花后67~81 d,SNI活性總體呈增加趨勢,之后SNI活性的變化逐漸趨于穩(wěn)定狀態(tài)。噴施生物活性水處理初期(即花后60~74 d),A、B處理的SNI活性高于對照;在花后74~88 d,A、B、C處理的SNI活性均高于對照,D處理的SNI活性低于對照,而至采收期(花后95 d),D處理果實(shí)的SNI活性又有所增大,并顯著高于對照。
圖5表明,在果實(shí)發(fā)育進(jìn)入轉(zhuǎn)色期后,不同生物活性水處理葡萄果實(shí)的CBAI活性的變化趨勢基本一致,總體上均呈降低趨勢。在花后60~67 d,A、B、D處理果實(shí)的CBAI活性逐漸增大,并于花后67 d達(dá)到高峰,67~74 d降低,74~81 d升高,并于81 d時(shí)再一次達(dá)到高峰,但此時(shí)各個(gè)處理(除D處理外)的CBAI活性均顯著低于花后67 d時(shí)的活性;81~95 d各處理CBAI活性呈下降趨勢。C處理和CK的 CBAI活性在花后60~74 d呈下降趨勢,在花后74~81 d呈上升趨勢,并于花后81 d時(shí)達(dá)到峰值,之后下降。在轉(zhuǎn)色期后,不同生物活性水處理葡萄果實(shí)的CBAI活性均高于對照,且差異顯著。
由圖6可見,不同處理葡萄果實(shí)發(fā)育過程中的可滴定酸含量在花后53~67 d均快速降低,而花后67 d之后,葡萄果實(shí)中的可滴定酸含量降低較慢。由圖6可知,不同生物活性水處理對可滴定酸含量的影響有明顯差異,且低稀釋倍數(shù)的生物活性水有促進(jìn)可滴定酸穩(wěn)定的效果。在處理早期(即花后53~67 d),A、B處理可降低可滴定酸含量,且效果較為明顯,隨著生物活性水稀釋倍數(shù)的增大,果實(shí)的可滴定酸含量呈增加趨勢,且D處理的作用效果相對較強(qiáng)。在處理后期(即花后74~95 d),C處理果實(shí)可滴定酸含量較其他處理低,D處理的可滴定酸含量較高。在果實(shí)的發(fā)育過程中,A、B處理的可滴定酸含量在花后80 d已基本穩(wěn)定。
圖4 生物活性水對葡萄果實(shí)發(fā)育過程中可溶性中性轉(zhuǎn)化酶(SNI)活性的影響
圖6 生物活性水對果實(shí)發(fā)育過程中可滴定酸含量的影響
生物活性水不僅僅是生態(tài)環(huán)保液態(tài)肥,還可以作為植物調(diào)節(jié)劑[26-27],為植物提供易被吸收的無機(jī)態(tài)營養(yǎng)物質(zhì)以及有益微生物次級(jí)代謝物,對植物生長、生理具有重要影響,而且可以保護(hù)植物在逆境下生長,同時(shí)含有有益微生物,可改善土壤中好氣性微生物活性,抑制病源微生物的繁衍。寧夏賀蘭山東麓作為優(yōu)質(zhì)釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)之一,土壤多為砂質(zhì)土壤且地力貧瘠。本試驗(yàn)研究了不同稀釋倍數(shù)的生物活性水對釀酒葡萄果實(shí)品質(zhì)及果實(shí)發(fā)育過程中糖酸積累規(guī)律的影響,結(jié)果表明,生物活性水對葡萄的可溶性總糖含量影響不大,但可降低總酚含量及提高果實(shí)色素、葡萄皮單寧含量,這與馬麗[28]、田義等[29]的報(bào)道相似,其原因可能是花色苷的形成需要可溶性糖[30],色素顯著升高,可溶性糖更多的參與色素的形成,以致總糖含量升高不顯著。生物活性水稀釋倍數(shù)過大會(huì)抑制葡萄籽單寧含量,但會(huì)增加果實(shí)的可滴定酸含量,這可能是由于稀釋倍數(shù)較大時(shí),生物活性水中不同的有效成分所產(chǎn)生的效應(yīng)大小不一所致。不同稀釋倍數(shù)生物活性水處理對葡萄的色素、單寧、總酚、可滴定酸含量均有明顯影響,但將生物活性水原液稀釋到400倍對葡萄進(jìn)行噴施,可以顯著提高葡萄中的可滴定酸、色素、皮單寧含量。
葡萄果實(shí)發(fā)育過程中可溶性糖和酸的積累變化可以體現(xiàn)葡萄果實(shí)的成熟狀況,也能夠反映生物活性水對葡萄各個(gè)發(fā)育期的影響,同時(shí)糖和酸也是葡萄酒釀造過程中的重要品質(zhì)參考指標(biāo)。釀酒葡萄果實(shí)在進(jìn)入轉(zhuǎn)色初期時(shí),其可溶性糖含量低,可滴定酸含量高,隨著果實(shí)的成熟,其可滴定酸含量降低,可溶性糖含量升高。不同生物活性水處理對葡萄糖酸積累的變化趨勢無顯著影響,但在各個(gè)時(shí)期對糖酸含量的影響表現(xiàn)出一定的差異。在轉(zhuǎn)色初期,低稀釋倍數(shù)的生物活性水可顯著降低果實(shí)可滴定酸含量,增高可溶性總糖、還原糖含量,高稀釋倍數(shù)的生物活性水可增高果實(shí)可滴定酸含量,降低可溶性總糖、還原糖含量。在轉(zhuǎn)色后期,生物活性水稀釋倍數(shù)過大或過小對可滴定酸含量影響不大,稀釋200倍時(shí)可顯著降低可滴定酸含量,而且低稀釋倍數(shù)的生物活性水可提高還原糖含量。
葡萄果實(shí)中的糖分、有機(jī)酸、單寧、總酚、花色素以及風(fēng)味物質(zhì)是評價(jià)葡萄品質(zhì)的重要指標(biāo),而糖是諸因素的基礎(chǔ),蔗糖代謝酶是糖積累的重要影響因子。蔗糖代謝酶主要包括蔗糖轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合成酶2種,其中轉(zhuǎn)化酶在果實(shí)糖分積累中起主要作用[31]。近年來,有關(guān)蔗糖代謝酶與果實(shí)糖積累之間存在密切聯(lián)系的報(bào)道已有很多。本研究發(fā)現(xiàn),葡萄果實(shí)中不同的酶對糖積累的影響不同,在葡萄進(jìn)入轉(zhuǎn)色期后,酸性轉(zhuǎn)化酶的活性始終高于中性轉(zhuǎn)化酶以及細(xì)胞壁結(jié)合的酸性轉(zhuǎn)化酶,且細(xì)胞壁結(jié)合的酸性轉(zhuǎn)化酶活性高于中性轉(zhuǎn)化酶,但這3種酶活性基本上均隨著果實(shí)的成熟而降低,這可能與葡萄果實(shí)細(xì)胞中的酸性大小有關(guān),在合適的pH值下,酶的活性才能達(dá)到最活躍狀態(tài),pH過低或過高均會(huì)抑制酶的活性。葡萄果實(shí)是主要的庫器官,蔗糖作為運(yùn)輸物質(zhì)經(jīng)韌皮部進(jìn)入到果實(shí)后,在果實(shí)中主要是被蔗糖轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化為還原糖貯存在果實(shí)細(xì)胞中,因此葡萄果實(shí)中的蔗糖含量很少,這與本試驗(yàn)中果實(shí)的可溶性總糖主要以還原糖的形式存在一致。本試驗(yàn)研究了不同稀釋倍數(shù)的生物活性水對葡萄蔗糖轉(zhuǎn)化酶的影響,結(jié)果表明,生物活性水對蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性有顯著的影響,適當(dāng)稀釋倍數(shù)的生物活性水可以大大提高葡萄果實(shí)蔗糖轉(zhuǎn)化酶的活性。
(1)不同稀釋倍數(shù)的生物活性水對釀酒葡萄蛇龍珠果實(shí)可溶性總糖含量無顯著影響,但均可提高葡萄皮單寧及色素含量,降低總酚含量。生物活性水原液稀釋400倍時(shí)可以顯著提高葡萄果實(shí)中的有機(jī)酸、色素和葡萄皮單寧含量,并降低糖酸比;稀釋200倍時(shí)可以顯著降低葡萄果實(shí)中的有機(jī)酸含量,提高色素、葡萄皮單寧和葡萄籽單寧含量及糖酸比。
(2)在葡萄果實(shí)發(fā)育進(jìn)入轉(zhuǎn)色期以后,葉面噴施稀釋50,100倍生物活性水,可以促進(jìn)果實(shí)可溶性總糖及還原糖的積累;噴施處理前期,稀釋200及400倍的生物活性水有降低果實(shí)可溶性糖和還原糖含量的趨勢,在處理后期均可以促進(jìn)可溶性總糖及還原糖的積累。
(3)稀釋50及100倍的生物活性水均可提高葡萄果實(shí)可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶、中性轉(zhuǎn)化酶和細(xì)胞壁結(jié)合的酸性轉(zhuǎn)化酶活性;稀釋400倍時(shí)可提高可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶和細(xì)胞壁結(jié)合的酸性轉(zhuǎn)化酶的活性。
(4)葡萄果實(shí)發(fā)育進(jìn)入轉(zhuǎn)色期以后,稀釋400倍的生物活性水有提高果實(shí)有機(jī)酸含量的作用,稀釋200倍則可使果實(shí)有機(jī)酸含量降低。
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