花椒籽種皮黑色素理化性質(zhì)和抗氧化活性的研究

楊秀芳，王改利，馬養(yǎng)民

（陜西科技大學(xué) 1.教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 西安 710021）

0 前言

植物黑色素（melanin）是一種無(wú)定性的大分子物質(zhì)，一般難溶于水，不溶于有機(jī)溶劑，且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，性能各異[1].黑色素不僅是一類(lèi)光保護(hù)劑、抗輻射劑、螯合劑、生物抗氧化劑[2]和免疫促進(jìn)劑[3]，而且還是一類(lèi)生物半導(dǎo)體材料[4].近期研究發(fā)現(xiàn)，黑色素具有抗蛇毒[5]、抗癌[6]、治療帕金森癥[7]等作用，這為現(xiàn)代醫(yī)藥和保健行業(yè)的發(fā)展提供了理論依據(jù).作者以花椒籽種皮為原料，使用大孔吸附樹(shù)脂純化黑色素，對(duì)其理化性質(zhì)和抗氧化活性進(jìn)行了探討，旨在為該黑色素的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

花椒籽：陜西韓城金太陽(yáng)花椒有限責(zé)任公司；福林酚試劑：上海三杰生物技術(shù)有限公司；DM130大孔吸附樹(shù)脂：河北滄州吸附材料科技有限公司；其他試劑均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；恒溫水浴鍋：上海華晨醫(yī)用儀表有限公司；水循環(huán)真空泵：鄭州杜普儀器廠；搖床：上海浦東物理光學(xué)儀器廠.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花椒籽種皮黑色素粗品及樹(shù)脂純化粗品的制備

稱(chēng)取花椒籽500 g，加入石油醚1 500 mL，浸泡24 h，過(guò)濾，稱(chēng)取脫脂后的花椒籽100 g，加入濃度為1.3 mol/L 的NaOH 1 000 mL，在90 ℃下回流提取1 h，提取液離心過(guò)濾后反復(fù)用11 mol/L HCl酸化，得到黑色素粗品.將得到的粗品使用大孔吸附樹(shù)脂DM130 純化后，干燥，備用.

1.3.2 花椒籽種皮黑色素結(jié)構(gòu)歸屬

采用薄層色譜試驗(yàn)用1%的FeCl3-乙醇溶液與鐵氰化鉀水溶液等量混合作顯色劑，點(diǎn)板，若顯藍(lán)-紫色斑點(diǎn)則表明為酚類(lèi)物質(zhì)；三氯化鐵試驗(yàn)：取花椒籽黑色素的酸性乙醇提取液1 mL，加1 %FeCl3-乙醇溶液1～2 滴，若顯綠色則表明為酚類(lèi)物質(zhì).且以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)參考GB/T 8313—2008[8]中Folin-Ciocalteu 比色法（略有改動(dòng)）.

1.3.3 光熱穩(wěn)定性

取經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂純化后的黑色素溶液，分別在室內(nèi)自然光照射0、1、3、5、7、14、21、28 d，并在0、20、40、60、80、100 ℃下加熱1 h，冷卻后采用Folin-Ciocalteu 比色法，分別測(cè)定其吸光度.

1.3.4 pH 穩(wěn)定性

取10 mL 純化后黑色素溶液，分別用NaOH和HCl 調(diào) 節(jié)pH 值 為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，采用Folin-Ciocalteu 比色法，測(cè)定各溶液的吸光度.

1.3.5 氧化劑與還原劑穩(wěn)定性

分別稱(chēng)取KMnO4、K2Cr2O7和Na2SO30.01 g，溶于100 mL 水中，分別加入純化后的黑色素溶液10 mL，混合，然后分別在0、5、10、15、24、48 h，采用Folin-Ciocalteu 比色法測(cè)定其吸光度.

1.3.6 金屬離子穩(wěn)定性

分別配制濃度為0.015 mol/L 的Mg2+、Fe2+、Zn2+、K+、Ca2+、Cr3+、Sn4+、Fe3+、Cu2+離子溶液，各取1 mL 分別加入10 mL 純化后相同濃度的黑色素溶液，采用Folin-Ciocalteu 比色法，分別在0、24、48 h測(cè)定其吸光度.

1.3.7 蔗糖、淀粉和食鹽穩(wěn)定性

分別稱(chēng)取蔗糖、淀粉和食鹽0.01 g，溶于100 mL 水中，分別加入經(jīng)DM130 樹(shù)脂純化后的溶液10 mL，混合，然后分別在0、24、48 h，采用Folin-Ciocalteu 比色法測(cè)定其吸光度.

1.4 抗氧化活性試驗(yàn)方法

1.4.1 ·OH 清除

取0.5 mmol/L 鄰二氮菲溶液1.5 mL，加入pH 7.4 的磷酸鹽緩沖溶液2.0 mL，混勻后加入0.75 mmol/L FeSO41.0 mL，混勻.加入不同濃度濃縮液1.0 mL，于510 nm 處測(cè)定吸光度A2，然后加入0.1%雙氧水1.0 mL，37 ℃保溫1 h，用蒸餾水代替濃縮液，測(cè)吸光度記為A1，以蒸餾水代替雙氧水和樣品液測(cè)吸光度A0，以Vc 作對(duì)照.·OH 清除率為：，并計(jì)算IC50值.

取4.5 mL pH 7.4 的磷酸鹽緩沖溶液，分別加入不同濃度樣品溶液1 mL 和0.4 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻后反應(yīng)5 min，然后加入8 mol/L 的HCl 1 mL 終止反應(yīng)，在299 nm 處測(cè)其吸光度A1，以蒸餾水代替樣品液測(cè)吸光度A0，以Vc作對(duì)照，并計(jì)算IC50值.

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒籽種皮黑色素結(jié)構(gòu)歸屬

按照1.3.2 中薄層色譜試驗(yàn)顯藍(lán)-紫色斑點(diǎn)，三氯化鐵試驗(yàn)顯綠色，均表明花椒籽種皮黑色素為酚類(lèi)物質(zhì).

2.2 光熱穩(wěn)定性

花椒籽種皮黑色素在自然光下的吸光度值如圖1 所示，由圖1 可知，在自然光下花椒籽種皮黑色素隨時(shí)間的延長(zhǎng)吸光度值減少，但肉眼未看到明顯的顏色變化，表明其耐光性差，可能的原因是黑色素發(fā)生了氧化反應(yīng).不同溫度下花椒籽種皮黑色素的吸光度值如圖2 所示，由圖2 可知，在0～80 ℃下黑色素吸光度變化不大，但隨著溫度繼續(xù)升高吸光度值增加，表明在0～80 ℃下耐熱性良好.

圖1 花椒籽種皮黑色素在自然光下的吸光度值

圖2 不同溫度下花椒籽種皮黑色素的吸光度值

2.3 pH 穩(wěn)定性

花椒籽種皮黑色素在不同pH 下的吸光度值如圖3 所示.pH＜5 時(shí)黑色素產(chǎn)生沉淀；pH＞7 時(shí)隨著pH 增大吸光度值增大且顏色加深.可能的原因是堿性條件下黑色素以粒子形式存在，堿性越大離子越穩(wěn)定.

圖3 花椒籽種皮黑色素在不同pH 下的吸光度值

2.4 氧化劑與還原劑穩(wěn)定性

加入還原劑Na2SO3的花椒籽種皮黑色素的吸光度值如圖4 所示，由圖4 可知，隨著還原劑的加入黑色素的吸光度值明顯降低，表明其耐還原性差，原因可能是加入還原劑使黑色素的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化.加入氧化劑的花椒籽種皮黑色素的吸光度值如圖5 所示.由圖5 可知，加入氧化劑KMnO4和K2Cr2O7的黑色素溶液吸光度值基本不變，表明該色素對(duì)KMnO4和K2Cr2O7穩(wěn)定性良好.

圖4 加入還原劑的花椒籽種皮黑色素的吸光度值

圖5 加入氧化劑的花椒籽種皮黑色素的吸光度值

2.5 金屬離子穩(wěn)定性

加入離子Mg2+、Fe2+、Zn2+、K+、Cu2+和Fe3+的花椒籽種皮黑色素產(chǎn)生沉淀，取上清液進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖6.由圖6 可知，其中Cu2+和Fe3+溶液吸光度值增大，Mg2+、Fe2+、Zn2+、Ca2+、Cr3+、Sn4+、K+溶液吸光度值減少.原因可能是離子與黑色素的部分基團(tuán)結(jié)合形成沉淀，其中有些使該黑色素吸光度值增大，有些使其減少.

圖6 加入金屬離子的花椒籽種皮黑色素吸光度值

2.6 蔗糖、淀粉和食鹽穩(wěn)定性

加入蔗糖、淀粉和食鹽的花椒籽種皮黑色素的吸光度如圖7 所示，由圖7 可知，加入蔗糖、淀粉和食鹽的花椒籽種皮黑色素的吸光度值基本變化不大，表明花椒籽種皮黑色素可以作為天然的食品添加劑.

圖7 加入蔗糖、淀粉和食鹽的花椒籽種皮黑色素的吸光度

2.7 ·OH 清除（圖8）

由圖8 可知，花椒籽種皮黑色素抑制·OH 能力與Vc 相當(dāng)，在20～160 μg/mL 范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，其線性回歸方程為y=0.601x+0.033，R2=0.984 0，半數(shù)抑制濃度為IC50為66.63 μg/mL.

力比Vc 好，在10～60 μg/mL 內(nèi)呈線性相關(guān)，其線性回歸方程為y=1.527x-1.113，R2=0.992 4，半數(shù)抑制濃度為IC50為36.55 μg/mL.

圖8 花椒籽種皮黑色素對(duì)·OH 的清除

圖9 花椒籽種皮黑色素對(duì)的清除

3 結(jié)論

作者對(duì)花椒籽種皮黑色素的理化性質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明該黑色素屬于酚類(lèi)物質(zhì)，耐光性差，在0～80 ℃下耐熱性良好；當(dāng)pH＜5 時(shí)黑色素產(chǎn)生沉淀，pH ＞7 時(shí)吸光度值增大且顏色加深；對(duì)KMnO4和K2Cr2O7穩(wěn)定性良好；對(duì)Na2SO3穩(wěn)定性較差；該色素加入金屬離子Mg2+、Fe2+、Zn2+、K+、Cu2+和Fe3+的溶液產(chǎn)生沉淀，其中Cu2+和Fe3+溶液吸光度值增大，Mg2+、Fe2+、Zn2+、Ca2+、Cr3+、Sn4+、K+溶液吸光度值減少；加入蔗糖、淀粉和食鹽的該色素吸光度值基本不變，表明該黑色素是一種理想的食品添加劑；花椒籽種皮黑色素具有較好的抗氧化活性，其中清除·OH 能力與Vc 相當(dāng)，其IC50為66.63 μg/mL；清除能力比Vc 好，其IC50為36.55 μg/mL.該黑色素可作為天然抗氧化物質(zhì)的新來(lái)源.

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