陳 星 吳大偉 溫 超 周巖民

蛋白質(zhì)不僅為動物機(jī)體發(fā)育提供氨基酸，還為其代謝提供所需能量等［1］，所以飼料中蛋白質(zhì)的供應(yīng)對動物具有重要意義，且飼料中蛋白質(zhì)的質(zhì)量亦十分重要［2］。在加工和貯藏過程中，飼料中的蛋白質(zhì)在高溫、剪切、擠壓、輻射等作用下會發(fā)生氧化［3］，導(dǎo)致其營養(yǎng)價值降低。目前關(guān)于氧化蛋白質(zhì)對動物機(jī)體生理狀態(tài)的影響主要集中于體內(nèi)氧化應(yīng)激引起的蛋白質(zhì)修飾及其生理反應(yīng)［4-5］，而關(guān)于飼料氧化蛋白質(zhì)的攝入對動物機(jī)體的影響研究甚少。胰腺是消化系統(tǒng)中重要的腺體之一，其內(nèi)外分泌功能對體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和代謝以及對機(jī)體各種生理過程的調(diào)節(jié)至關(guān)重要［6］。熱處理是應(yīng)用廣泛的氧化修飾蛋白質(zhì)的方法之一。因此，本試驗以加熱氧化1、4及8 h的大豆蛋白質(zhì)飼喂肉雞，研究攝取氧化蛋白質(zhì)對肉雞胰腺功能的影響，以期為探討飼料源蛋白質(zhì)氧化后對動物的影響提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理方法

大豆分離蛋白質(zhì)(soy protein isolate，SPI)購自南通光合生物科技有限公司，水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪及粗灰分含量分別為 5.6%、86.2%、0.4%和4.9%。參照Tang等［7］的方法分別將大豆分離蛋白質(zhì)經(jīng)100℃烘箱加熱處理1、4及8 h。本實驗室前期研究［8］表明，熱處理會引起大豆分離蛋白質(zhì)的氧化修飾，正常大豆分離蛋白質(zhì)及經(jīng)1、4、8 h熱處理后大豆分離蛋白質(zhì)羰基含量分別為15.13、15.79、17.85、22.35 nmol/mg prot，巰基含量分別為 9.19、7.91、8.16、8.27 nmol/mg prot，總巰基基團(tuán) 含 量 分 別 為 108.06、98.07、84.44、86.48 nmol/mg prot，游 離 氨 含 量 分 別 為 0.79、0.74、0.70、0.69 μmol/mg prot。

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

選用1日齡愛拔益加(AA)肉雞320只，隨機(jī)分為4個組，每組8個重復(fù)，每個重復(fù)10只，分別飼喂4種飼糧:正常大豆分離蛋白質(zhì)飼糧(對照組)，熱處理1、4及8 h的大豆分離蛋白質(zhì)飼糧。試驗在江蘇省南京市康欣禽業(yè)有限公司進(jìn)行，試驗前對雞舍進(jìn)行徹底清洗、消毒。試驗雞采用籠養(yǎng)，24 h光照(白天自然光照，夜間白熾燈光照)，自由采食和飲水，免疫程序按常規(guī)進(jìn)行。雞舍1～7 d溫度控制在32℃左右，以后溫度逐漸下調(diào)至室溫，試驗期為21 d?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) g/kg

1.3 樣品的采集與制備

于試驗第14和21天，每重復(fù)選取與平均體重相近的肉雞1只，稱重后頸動脈采血于10 mL離心管中，傾斜室溫放置，待析出血清后于4℃下3 000×g離心15 min，血清分裝后于-20℃保存待測。雞只放血致死后，剖開腹腔，分離出胰腺，剔除周圍脂肪組織，用濾紙吸干血水后將胰腺裝入自封袋于-20℃保存，并計算胰腺相對重量。

取0.3 g左右的胰腺組織于10 mL離心管中，加入9倍體積4℃下預(yù)冷的0.86%生理鹽水，在冰水浴中勻漿后，于4℃下4 000×g離心15 min，上清液分裝后于-20℃保存用于測定各種消化酶活性。上清液中的蛋白質(zhì)含量用二喹啉甲酸(BCA)法測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.4 測定指標(biāo)和方法

1.4.1 胰腺消化酶活性

淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)進(jìn)行測定，蛋白酶活性用奚剛等［9］的方法進(jìn)行測定。

1.4.2 血清和胰腺中胰島素水平

血清和胰腺中胰島素水平均采用放射性免疫分析方法(試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所)測定，均以125I標(biāo)記，采用雙抗法進(jìn)行測定。

1.4.3 胰腺抗氧化指標(biāo)

胰腺中總抗氧化能力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽還原酶(GR)活性和還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)及丙二醛(MDA)含量均采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定，試劑配制和操作步驟均按說明書進(jìn)行，其中T-AOC采用化學(xué)比色法，T-SOD采用鄰苯三酚自氧化法，CAT采用紫外吸收法，GPx采用二硫代二硝基苯甲酸比色法，GSH和GSSG采用比色法，MDA采用硫代巴比妥酸法(TBA)。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2003初步整理后，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計，用單因子方差分析(oneway ANOVA)檢驗組間差異顯著性，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理大豆分離蛋白質(zhì)對肉雞胰腺相對重量的影響

如圖1所示，與對照組相比，飼喂熱處理大豆分離蛋白質(zhì)飼糧對14日齡肉雞胰腺相對重量無顯著影響(P＞0.05)，但各熱處理大豆分離蛋白質(zhì)飼糧均顯著提高了21日齡肉雞胰腺相對重量(P＜0.05)。

2.2 熱處理大豆分離蛋白質(zhì)對肉雞胰腺消化酶活性的影響

由表2可知，與對照組相比，各熱處理大豆分離蛋白質(zhì)飼糧對14日齡肉雞胰腺消化酶活性均無顯著影響(P＞0.05);熱處理8 h大豆分離蛋白質(zhì)飼糧使21日齡肉雞胰腺蛋白酶和胰蛋白酶活性顯著降低(P＜0.05)。

圖1 熱處理大豆分離蛋白質(zhì)對肉雞胰腺相對重量的影響Fig.1 Effects of heat treatment soy protein isolate on pancreatic relative weight of broilers

表2 熱處理大豆分離蛋白質(zhì)對肉雞胰腺消化酶活性的影響Table 2 Effects of heat treatment of soy protein isolate on pancreatic digestive enzyme activities of broilers

2.3 熱處理大豆分離蛋白質(zhì)對肉雞血清和胰腺胰島素水平的影響

由表3可知，與對照組相比，各熱處理大豆分離蛋白質(zhì)飼糧對14和21日齡肉雞血清和胰腺胰島素水平均無顯著影響(P＞0.05)。

2.4 熱處理大豆分離蛋白質(zhì)對肉雞胰腺抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知，與對照組相比，熱處理大豆分離蛋白質(zhì)飼糧對14日齡肉雞胰腺T-AOC、T-SOD、CAT活性及MDA含量均無顯著影響(P＞0.05);熱處理8 h大豆分離蛋白質(zhì)飼糧使21日齡肉雞胰腺 T-AOC(P=0.058)和 CAT(P=0.064)活性有所降低，但顯著增加了MDA含量(P＜0.05)。

2.5 熱處理大豆分離蛋白質(zhì)對肉雞胰腺谷胱甘肽系統(tǒng)指標(biāo)的影響

由表5可知，與對照組相比，熱處理大豆分離蛋白質(zhì)飼糧對14日齡肉雞胰腺GSH和GSSG含量、GSH/GSSG及 GR、GPx活性均無顯著影響(P＞0.05);熱處理8 h大豆分離蛋白質(zhì)飼糧使21日齡肉雞胰腺GSH/GSSG和GPx活性顯著下降(P＜0.05)，GR 活性有所降低(P=0.061)，但GSSG含量有升高趨勢(P=0.065)。

表3 熱處理大豆分離蛋白質(zhì)對肉雞血清和胰腺胰島素水平的影響Table 3 Effects of heat treatment of soy protein isolate on serum and pancreatic insulin level of broilers

表4 熱處理大豆分離蛋白質(zhì)對肉雞胰腺抗氧化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of heat treatment soy protein isolate on pancreatic antioxidant indices of broilers

表5 熱處理大豆分離蛋白質(zhì)對肉雞胰腺谷胱甘肽系統(tǒng)指標(biāo)的影響Table 5 Effects of heat treatment soy protein isolate on pancreatic glutathione redox system parameters of broilers

3 討論

3.1 熱處理大豆分離蛋白質(zhì)對肉雞胰腺相對重量的影響

胰腺相對重量是胰腺主要的功能性指標(biāo)之一，大小決定其代謝率高低［10］。李竹青等［11］研究發(fā)現(xiàn)，飼喂氧化酪蛋白質(zhì)顯著增加了小鼠胰腺的臟器指數(shù)。本試驗中，飼喂熱處理大豆分離蛋白質(zhì)飼糧對14日齡肉雞胰腺相對重量無顯著影響，但熱處理大豆分離蛋白質(zhì)飼糧顯著提高了21日齡肉雞胰腺相對重量，這與上述報道的結(jié)果相似，說明攝食氧化蛋白質(zhì)可能會引起肉雞胰腺代償性增大，這可能與氧化蛋白質(zhì)的難以消化有關(guān)［12］。此外，Mahmood等［13］研究發(fā)現(xiàn)，肉雞相對較低的采食量也會誘導(dǎo)其胰腺相對重量的增加，因此熱處理組肉雞胰腺的肥大也可能與其較低的采食量有關(guān)。

3.2 熱處理大豆分離蛋白質(zhì)對肉雞胰腺消化酶活性及血清和胰腺胰島素水平的影響

胰腺為混合性分泌腺體，由外分泌腺體和內(nèi)分泌腺體2部分組成，因此主要有外分泌和內(nèi)分泌2大功能。胰腺外分泌物胰液中所含的營養(yǎng)物質(zhì)降解酶如胰淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰脂肪酶等，是動物消化食物最主要、消化力最強(qiáng)的酶系［14］，因此胰液分泌紊亂會導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收異常，降低動物的生產(chǎn)性能。本試驗中，熱處理大豆分離蛋白質(zhì)飼糧對14日齡肉雞胰腺消化酶活性無顯著影響，但21日齡時肉雞胰腺中蛋白酶和胰蛋白酶活性降低，說明肉雞采食熱處理大豆分離蛋白質(zhì)飼糧會引起胰腺外分泌功能障礙。胰島素是由胰腺胰島B細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)糖代謝的重要激素，是胰腺內(nèi)分泌主要成分之一。本試驗中，熱處理大豆分離蛋白質(zhì)飼糧對14和21日齡肉雞血清和胰腺胰島素水平均無顯著影響，這說明肉雞采食氧化蛋白質(zhì)飼糧不影響胰腺內(nèi)分泌功能。

3.3 熱處理大豆分離蛋白質(zhì)對胰腺抗氧化指標(biāo)的影響

機(jī)體的氧化損傷程度可以通過對抗氧化防御系統(tǒng)的能力測得。T-AOC是反映機(jī)體整體抗氧化狀態(tài)的重要指標(biāo)，與機(jī)體健康程度密切相關(guān)［15］。本試驗中，熱處理大豆分離蛋白質(zhì)飼糧對14日齡肉雞胰腺T-AOC無顯著影響，但熱處理8 h大豆分離蛋白質(zhì)飼糧使21日齡肉雞胰腺T-AOC低于對照組，提示攝食氧化蛋白質(zhì)會削弱肉雞胰腺組織的總抗氧化防御能力。CAT能將組織中的過氧化氫分解為氧和水［16］。本試驗中，熱處理大豆分離蛋白質(zhì)飼糧對14日齡試驗肉雞胰腺CAT活性無顯著影響，但熱處理8 h大豆分離蛋白質(zhì)飼糧使21日齡肉雞胰腺CAT活性有所降低，說明肉雞攝食氧化蛋白質(zhì)會導(dǎo)致其胰腺組織清除活性氧(ROS)的能力下降，細(xì)胞受自由基的攻擊程度加重。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，其含量可以間接反映自由基的產(chǎn)生狀況和機(jī)體組織細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化程度［17］。本試驗中，熱處理大豆分離蛋白質(zhì)飼糧對14日齡肉雞胰腺M(fèi)DA含量無顯著影響，但熱處理8 h大豆蛋白質(zhì)分離蛋白質(zhì)飼糧使21日齡肉雞胰腺M(fèi)DA含量顯著升高，說明肉雞攝食氧化蛋白質(zhì)會引起其胰腺細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化程度增強(qiáng)。研究表明，飼喂加熱氧化大豆蛋白質(zhì)提高了小鼠胰腺自由基水平，降低了小鼠胰腺抗氧化能力，造成小鼠胰腺氧化還原狀態(tài)的失衡［18］，這與本試驗結(jié)果基本一致。

3.4 熱處理大豆分離蛋白質(zhì)對肉雞胰腺谷胱甘肽系統(tǒng)指標(biāo)的影響

GPx是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化物分解酶，它特異地催化還原型谷胱甘肽對氫過氧化物的還原反應(yīng)。一般認(rèn)為它在細(xì)胞內(nèi)能消除有害的過氧化物代謝產(chǎn)物，防止脂質(zhì)過氧化物對機(jī)體生物膜和組織的損傷，并防止脂質(zhì)過氧化物進(jìn)一步水解為有害物質(zhì)MDA。本試驗中，熱處理大豆分離蛋白質(zhì)飼糧對14日齡肉雞胰腺GPx活性無顯著影響，但熱處理8 h大豆分離蛋白質(zhì)飼糧使21日齡肉雞胰腺GPx活性顯著降低，相對較低的GPx活性可能會導(dǎo)致胰腺組織ROS的蓄積，增強(qiáng)細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，這與胰腺組織MDA含量的分析一致。谷胱甘肽是一種含巰基的小分子肽類物質(zhì)，包括還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)［19］。GSH能清除體內(nèi)的ROS，當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時，在GPx作用下，GSH被氧化成GSSG，而GSSG則可在GR的催化并在還原氫的參與下重新合成GSH［20］。GSH含量的降低及GSSG在機(jī)體組織內(nèi)的蓄積常被作為組織發(fā)生氧化應(yīng)激的標(biāo)志［21］，而GSH/GSSG是最能反映機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的指標(biāo)［22］。本試驗中，熱處理大豆分離蛋白質(zhì)飼糧對14日齡試驗肉雞胰腺GSH/GSSG無顯著影響，但熱處理8 h組胰腺GSH/GSSG顯著降低，說明攝食氧化蛋白質(zhì)會引起肉雞胰腺組織氧化還原狀態(tài)失衡，導(dǎo)致其發(fā)生氧化損傷，GSH/GSSG的降低主要是GSSG含量的升高引起，而GSSG含量的升高可能與GR的活性下降有關(guān)。值得注意的是，本試驗中GSH含量并未受熱處理大豆分離蛋白質(zhì)飼糧的影響，這可能是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、GPx及 GR綜合作用的結(jié)果［23］。

4 結(jié)論

攝食熱處理大豆分離蛋白質(zhì)飼糧對肉雞早期(14日齡)胰腺功能相關(guān)指標(biāo)無顯著影響，但隨著攝食熱處理大豆分離蛋白質(zhì)飼糧時間延長(21日齡)，肉雞胰腺代償性增大，胰腺胰蛋白酶和蛋白酶活性降低，并伴隨胰腺抗氧化防御能力的降低，說明攝食熱處理大豆分離蛋白質(zhì)飼糧一定時間后會對肉雞胰腺功能產(chǎn)生負(fù)面作用。

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