周 薇 徐方華 陳 娜 高青山 李香子

(延邊大學農學院，延吉 133000)

α－亞麻酸(c9，c12，c15-C18∶3，Lna)是一種廣泛存在于天然牧草中含有3個雙鍵的十八碳(C18)長鏈不飽和脂肪酸［1］。Harfoot等［2］研究發(fā)現(xiàn)，α－亞麻酸在瘤胃微生物的生物加氫作用下還原生成反11，順15－亞油酸(t11，c15-C18∶2)，通過進一步生物加氫還原為反11－油酸(t11-C18∶1)和硬脂酸(C18∶0)等代謝產(chǎn)物。Polan等［3］和 Garton［4］通過體外試驗驗證了 Harfoot等［2］的結果，發(fā)現(xiàn)α－亞麻酸氫化過程中會形成順9，反11－共軛亞油酸(c9，t11-CLA)和 t11-C18∶1 等中間產(chǎn)物，現(xiàn)在這種氫化路徑被廣泛接受。Abughazaleh等［5］和 Jenkins等［6］研究發(fā)現(xiàn)，t11-C18∶1 氫化過程中不僅可以形成C18∶0，也可以通過雙鍵異構化作用形成反9－油酸(t9-C18∶1)，且這種異構化作用受瘤胃液pH變化的影響。Zheng等［7］通過在奶牛飼糧中添加豆油推測出亞麻酸(C18∶3)可以增加十二指腸中t11-C18∶1含量，并進一步增加牛乳中c9，t11-CLA 含量。Wu等［8］研究發(fā)現(xiàn)，飼糧高水平的亞油酸(C18∶2)會降低瘤胃中C18∶0含量，增加單烯脂肪酸的累積，但Avila等［9］研究認為，增加脂肪的添加可以提高氫化率。二者結果的差異可能是脂肪酸種類及添加水平差別造成的［10］，脂肪酸水平對氫化作用及機理有待研究。除此之外，飼糧精粗比也可以影響氫化率，高精飼糧與低精飼糧相比可以顯著降低n6亞油酸(C18∶2 n6)及 α－亞麻酸的氫化率［10］。

共軛亞油酸(CLA)對人體有很重要的健康意義，如抗癌、減輕動脈硬化、減肥、增強免疫力等［11－12］。目前關于亞麻酸氫化過程是否生成CLA說法不一。Wasowska等［13］通過在體外發(fā)酵試驗中添加亞麻酸發(fā)現(xiàn)經(jīng)過生物氫化后可以形成2種亞麻酸異構體，但沒有c9，t11-CLA的累積。而Choi等［14］通過在模擬人工瘤胃中對比發(fā)現(xiàn)，添加亞麻酸對總CLA的增加趨勢比添加亞油酸更顯著。因此，確定亞麻酸等n-3不飽和脂肪酸在氫化過程中是否形成CLA異構體是特別重要的。有研究發(fā)現(xiàn)，與CLA相比，共軛亞麻酸(CLnA)對腫瘤細胞有更強的毒性［15］，但有關α－亞麻酸代謝生成CLnA的相關報道還很少。本試驗研究了α－亞麻酸對瘤胃體外發(fā)酵特性及生物氫化中間產(chǎn)物的影響，以期明確瘤胃內α－亞麻酸氫化及代謝過程，為確定CLA及CLnA產(chǎn)生途徑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及瘤胃液采集

選擇4頭體重為(350±12)kg安裝有永久性瘤胃瘺管的成年健康延邊黃牛，以供瘤胃液的采集。試驗動物每天飼喂2次(07:30和18:00)，自由飲水。基礎飼糧精粗比為60∶40，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(DM basis) %

1.2 試驗設計

根據(jù)培養(yǎng)底物中α－亞麻酸添加水平的不同，分為4組，設添加水平分別為0(對照組，CON組)、1.5%(低添加水平組，LL 組)、3.0%(中添加水平組，ML 組)、4.5%(高添加水平組，HL 組)，每組設3個重復。

1.3 培養(yǎng)方法

采用體外批次培養(yǎng)法，培養(yǎng)底物組成與瘤胃液供體?；A飼糧組成完全相同。在晨飼2 h后，從4頭牛瘤胃內背囊、背盲囊、腹囊、腹盲囊不同位點采集足量瘤胃內容物，在混合后依次通過4層和12層紗布過濾，收集在經(jīng)過預熱的保溫瓶內，恒溫39℃，通入飽和二氧化碳。將培養(yǎng)底物粉碎過篩混合均勻，取2 g加入培養(yǎng)瓶內;加入瘤胃液及緩沖液(配制參考M cDougall［16］的方法)各45 m L。在培養(yǎng)瓶內加入乳化后的α－亞麻酸(美國Sigma公司)，通入飽和二氧化碳，用膠塞及鋁蓋密封放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱內培養(yǎng)12 h(135 r/m in，39 ℃)。

1.4 測定指標及方法

在培養(yǎng)3、6和12 h分別取體外培養(yǎng)液1 m L用靛酚比色法測定氨態(tài)氮含量。使用安捷倫氣相色譜儀(GC－7890A)采用外標法測定揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度，火焰離子檢測器(FID)，進樣溫度170℃，柱溫120℃，檢測器溫度200℃，毛細管柱為 Agilent 19091F－112(25 m×320 μm×0.5 μm)。用雷磁pHS－3C pH計測定培養(yǎng)液pH。在培養(yǎng)瓶內加入1m L內標溶液［1 g十三碳酸(C13∶0，美國Sigma公司)用氯仿定容至100 m L］、30 m L脂肪提取液(氯仿∶甲醇體積比為2∶1);培養(yǎng)液內脂肪提取參照Folch等［17］的方法;脂肪酸甲基化參照Lepage等［18］的方法;脂肪酸含量使用安捷倫氣相色譜儀(GC－7890A)測定，配備100 m石英毛細管柱(Supelco SPTM－2560，0.25 mm)。進樣口和檢測器溫度分別為 240、250℃;分流比 1∶100;柱箱溫度140℃，持續(xù)2 m in，增至240℃，速度為4℃/m in，并保持40 m in。CLA異構體采用c9，t11-CLA(91396，F(xiàn)luka，美國)、反 10，順 12－共軛亞油酸(t10，c12-CLA)(美國 Fluka公司)標準品進行定量分析;其他脂肪酸標準品均購自美國Supelco公司。順 9，反 11，順15－共軛亞麻酸(c9，t11，c15-CLnA，75%)標準品由 Chouinard教授(STELA:INAF-UniversitéLaval，加拿大)贈送。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2007，分析采用 SPSS 17.0中的one-way ANOVA程序進行方差分析，多重比較采用Duncan氏法進行。數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示。

2 結果

2.1 α－亞麻酸對瘤胃體外發(fā)酵特性的影響

由表2可見，隨培養(yǎng)時間延長，各組培養(yǎng)液pH均降低，氨態(tài)氮含量及總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)、乙酸、丙酸、丁酸濃度均增加。同一時間點，pH隨α－亞麻酸添加水平增加而降低，但組間差異均不顯著(P＞0.05)。在3和6 h，ML組和 HL組氨態(tài)氮含量顯著或極顯著低于CON組(P＜0.05或P＜0.01)。ML組和HL組TVFA濃度在3 h時極顯著低于CON組和 LL組(P＜0.01)，HL組在6和12 h時顯著或極顯著低于其他各組(P＜0.05或P＜0.01)。HL組乙酸濃度在各時間點顯著或極顯著低于其他各組(P＜0.05或 P＜0.01)。HL 組丙酸濃度在3 h顯著低于其他各組(P＜0.05)，CON組和HL組在6 h時極顯著低于ML組和LL組(P＜0.01)，CON組在12 h顯著或極顯著低于其他各組(P＜0.05或 P＜0.01)。ML 組和 HL 組丁酸濃度均極顯著低于CON組和LL組(P＜0.01)。LL組乙酸/丙酸在3 h時顯著低于其他各組(P＜0.05)，ML組和HL組在6和12 h時間顯著或極顯著低于 CON 組和 LL 組(P＜0.05 或 P＜0.01)。

2.2 α－亞麻酸對瘤胃體外發(fā)酵培養(yǎng)液 C 18脂肪酸含量的影響

由表3可知，隨培養(yǎng)時間延長，C18∶0含量隨培養(yǎng)時間延長緩慢增加;LL組及HL組t11-C18∶1含量增加，CON組及ML組在3～6 h升高，隨后下降;LL組和ML組 t9-C18∶1含量不斷增加，CON組和 HL組 t9-C18∶1含量逐漸下降，ML組c9-C18∶1含量逐漸升高，HL組先升高，在培養(yǎng)6 h后下降，CON組和LL組均逐漸降低;CON組2種共軛亞油酸(c9，t11-CLA和t10，c12-CLA)變化幅度較小，LL組和ML組均逐漸降低，HL組c9，t11-CLA含量逐漸降低，而t10，c12-CLA含量先降低，在6 h以后略有升高;CON組和LL組順9，順12－亞油酸(c9，c12-C18∶2)含量逐漸下降，其余 2組逐漸升高;CON組及 HL組反 9，反 12－亞油酸(t9，t12-C18∶2)含量不斷減少，其他2組先降低，再升高;CON 組未檢測到 t11，c15-C18∶2、c9，t11，c15-CLnA 和順9，反 13，順 15－共軛亞麻酸(c9，t13，c15-CLnA)，HL 組 c9，t11，c15-CLnA 含量先降低再增加，c9，t13，c15-CLnA含量變化與之相反，LL組和ML組這2種CLnA含量均逐漸降低;ML組和HL組α－亞麻酸含量逐漸升高，LL組逐漸降低，CON組變化幅度較小;γ－亞麻酸(C18∶3 n6)含量變化幅度較小;LL組和HL組總CLA含量逐漸降低，ML組先降低，后略有升高;LL組和ML組總CLnA含量逐漸降低，HL組先降低，后升高。

同一時間點，組間比較:試驗組C18∶0含量均極顯著低于CON組(P＜0.01)，且試驗組間差異不顯著(P＞0.05);LL 組油酸(t11-C18∶1、t9-C18∶1、c9-C18∶1)含量均顯著或極顯著高于其他各組(P＜0.05或 P＜0.01);ML 組和 HL 組 c9，t11-CLA 含量在3和6 h極顯著高于其他各組(P＜0.01)，ML組在12 h極顯著高于其他各組(P＜0.01);試驗組t10，c12-CLA含量均極顯著高于 CON組(P＜0.01)，LL組在 3 h極顯著高于 ML組和 HL組(P＜0.01)，6 h 時試驗組間差異不顯著(P＞0.05)，ML組和 HL組在12 h時顯著高于 LL組(P＜0.05);LL 組亞油酸(時間點 t9，t12-C18∶2 和 3 和6 h時的c9，c12-C18∶2)含量均極顯著高于其他各組(P＜0.01);HL 組 CLnA(各時間點 c9，t11，c15-CLnA和3和6 h時 c9，t13，c15-CLnA)含量均極顯著高于其他各組(P＜0.01);亞麻酸(α－亞麻酸和γ－亞麻酸)含量總體上為ML組較高;總CLA含量3 h時為ML組顯著或極顯著高于其他各組(P＜0.05或 P＜0.01)，6 h 時 HL 組極顯著高于其他各組(P＜0.01)，12 h時 ML組和 HL組極顯著高于其他各組(P＜0.01);總 CLnA含量均為 HL組極顯著高于其他各組(P＜0.01)，ML組極顯著 高于 LL組和 CON 組(P＜0.01)。

表2 α－亞麻酸對瘤胃體外發(fā)酵特性的影響Table 2 Effects ofα-linolenic acid on in vitro rum inal fermentation characteristics

表3 α－亞麻酸對瘤胃體外發(fā)酵培養(yǎng)液C18脂肪酸含量的影響Table 3 Effects ofα-linolenic acid on C18 fatty acid contents in culturemedium after in vitro rum inal fermentation mg/dL

續(xù)表3

3 討論

α－亞麻酸的添加顯著改變了瘤胃發(fā)酵模式，降低乙酸和丁酸濃度，提高了丙酸濃度，進而降低乙酸/丙酸，并減少了氨態(tài)氮生成，這與張春梅等［19］和 Zhang 等［20］的研究相符，劉亮［21］在人工瘤胃試驗中添加亞麻酸也得到相同效果。本試驗中，培養(yǎng)液pH隨α－亞麻酸添加水平增加而下降，這與魏宏陽等［22］的研究不相符合。魏宏陽等［22］認為，VFA濃度減少會導致瘤胃液pH上升。周倩等［23］研究中發(fā)現(xiàn)，隨添加不飽和油脂不飽和度的增加，瘤胃液pH有降低趨勢。本試驗發(fā)現(xiàn)，游離不飽和脂肪酸在低濃度下，減少了TVFA濃度，但影響不顯著，同時的確可以使pH在一定程度上上升。但當添加高水平α－亞麻酸時，pH產(chǎn)生一定程度的下降，可能是由于高水平α－亞麻酸使瘤胃內菌群發(fā)生了變化，其具體原因有待進一步研究。

在本試驗中，C18∶0隨培養(yǎng)時間延長累積增加，但與α－亞麻酸添加水平變化趨勢相反，這可能是α－亞麻酸在氫化過程中形成順9，反12－亞油酸(c9，t12-C18∶2)、CLnA 及 CLA 累積在培養(yǎng)液內，一定程度上阻止了t11-C18∶1氫化為C18∶0造成的。Song等［24］在研究中發(fā)現(xiàn)，游離的亞油酸可以阻止 t11-C18∶1及 t9-C18∶1完成氫化過程。而培養(yǎng)過程中，t9-C18∶1 及 c9-C18∶1 的累積，也與pH的變化有關。AbuGhazaleh等［5］研究發(fā)現(xiàn)，當培養(yǎng)液pH低于6.5時，油酸的雙鍵會出現(xiàn)在＜C10的位置上。Kim等［25］發(fā)現(xiàn)，只有在培養(yǎng)液中的亞油酸含量足夠抑制生物氫化作用，CLA含量才會顯著增加。正是因為這種抑制作用會同時生成CLA和反式油酸。本試驗中，培養(yǎng)3 h時，培養(yǎng)液中c9，c12-C18∶2含量隨α－亞麻酸添加水平增加而減少，而可能是由于高水平的α－亞麻酸促進c9，c12-C18∶2 生成 c9，t11-CLA。本試驗中，c9，t11-CLA含量隨α－亞麻酸添加水平升高而增加，二者間存在劑量效應關系。培養(yǎng)6 h時，c9，c12-C18∶2逐漸消耗，由生成CLA轉而偏向生成反式油酸，因此培養(yǎng)液中反式油酸含量增加，而CLA變化趨勢相對平緩。培養(yǎng)12 h時，LL組及HL組仍偏向于生成反式油酸，而ML組則偏向于生成CLA。LL組t9，t12-C18∶2隨在培養(yǎng)過程中大量累積，說明低水平的α－亞麻酸可能會使反式亞油酸大量累積。而ML組、HL組 t9，t12-C18∶2含量較低并隨培養(yǎng)過程無變化或降低，可能是高水平不飽和脂肪酸促進了氫化的進行，并使一部分反式亞油酸轉化為亞油酸，這也就解釋了ML組和HL組亞油酸隨時間延長含量增加的現(xiàn)象。Hughes等［26］通過分離和鑒定溶纖維丁酸弧菌，證實了pH中性時c9，t11-C18∶2還原酶的活性最大。本試驗中，CON組在各時間點均未檢測到2種CLnA及t11，c15-C18∶2，說明了 α－亞麻酸的氫化過程只有在高于一定水平后才會發(fā)生。在瘤胃內，α－亞麻酸異構為c9，t11，c15-CLnA，進而通過加氫作用轉化為 t11，c15-C18∶2［2，27－28］。本試驗中，M L、HL 組t11，c15-C18∶2在各培養(yǎng)時間點與CON組比均有顯著增加，LL組隨培養(yǎng)時間增加含量不斷降低，這可能是由于其異構化的作用。而ML組及HL組在3 h之后含量不斷累積，可能是由于培養(yǎng)液pH下降低于了6.2(表2)，抑制了異構酶和氫化酶的作用。有研究表明，當pH低于6.0時包括溶纖維素丁酸弧菌和白色瘤胃球菌在內的纖維素分解菌的生長繁殖會受到抑制，而這些纖維素分解菌也是參與氫化及異構反應的主要微生物［1，29］，隨后的 c9，t11，c15-CLnA 和 t11，c15-C18∶2 含量變化趨勢與之類似。總CLnA含量隨α－亞麻酸添加水平的上升而增加，說明其二者之間存在一定劑量效應關系。6 h之后總CLnA及總CLA含量隨培養(yǎng)時間延長消失速度變慢，進一步證實了pH低于6.0使得氫化微生物繁殖受到抑制，氫化過程減慢，進而使CLA及CLnA在培養(yǎng)液中累積。

4 結論

飼糧中添加α－亞麻酸可以改變瘤胃發(fā)酵模式，產(chǎn)生多種油酸異構體，促進瘤胃內 t11，c15-C18∶2、CLA和CLnA的累積，且總 CLnA 與 α－亞麻酸存在劑量效應關系。

［1］ LOURENCO M，RAMOS-MORALES E，WALLACE R J.The role of m icrobes in rumen lipolysis and biohydrogenation and their manipulation［J］.Animal，2010，4(7):1008－1023.

［2］ HAFOOT C G，HAZLEWOOD G P.Lipidmetabolism in the rumen［M］//HOBSON P N.The rumen m icrobial ecosystem.Netherlands:Springer，1998:382－426.

［3］ POLAN C E，MCNEILL JJ，TOVE C B.Biohydrogenation of unsaturated fatty acids by rumen bacteria［J］.Journal of Bacteriology，1964，88(4):1056－1064.

［4］ GARTON G A.Fatty acid metabolism in rum inants［J］.Biochem istry of Lipids，1977，14:337－370.

［5］ ABUGHAZALEH A A，RILEY M B，THIES E E，et al.Dilution rate and pH effects on the conversion of oleic acid to trans C18∶1 positional isomers in continuous culture［J］.Journal of Dairy Science，2005，88(12):4334－4341.

［6］ JENKINS T C，ABUGHAZALEH A A，F(xiàn)REEMAN S，et al.The production of 10-hydroxystearic and 10-ketostearic acids is an alternative route of oleic acid transformation by the rum inalm icrobiota in cattle［J］.The Journal of Nutrition，2006，136(4):926－931.

［7］ ZHENG H C，LIU JX，YAO JH，etal.Effects of dietary sources of vegetable oils on performance of highyielding lactating cow s and conjugated linoleic acids m ilk［J］.Journal of Dairy Science，2005，88(6):2037－2042.

［8］ WU Z，OHAJURUKA O A，PALMQUIST D L.Rum inal synthesis，biohydrogenation，and digestibility of fatty acids by dairy cows［J］.Journal of Dairy Science，1991，74(9):3025－3034.

［9］ AVILA C D，DEPETERS E J，PEREZ-MONTIH，et al.Influences of saturation ratio of supplemental dietary fat on digestion and m ilk yield in dairy cow s［J］.Journal of Dairy Science，2000，83(7):1505－1519.

［10］ 孫攀峰，姚建紅，劉建新.瘤胃十八碳不飽和脂肪酸氫化的研究進展［J］.動物營養(yǎng)學報，2007，19(增刊):508－514.

［11］ PARK Y，STORKSON JM，ALBRIGHT K J，et al.Evidence that the trans-10，cis-12 isomer of conjugated linoleic acid induces body com position changes in m ice［J］.Lipids，1999，34(3):235－241.

［12］ AZAIN M J，HAUSMAN D B，SISK M B，et al.Dietary conjugated linoleic acid reduces rat adipose tissue cell size rather than cell number［J］.The Journal of Nutrition，2000，130(6):1548－1554.

［13］ IGARASHIM，M IYAZAWA T.New ly recognized cytotoxic effect of conjugated trienoic fatty acids on cultured human tumor cells［J］.Cancer Letters，2000，148(1):173－179.

［14］ WASOWSKA I，MAIA M R G，NIEDZW IEDZKA K M，etal.Influence of fish oil on rum inal biohydrogenation of C18 unsaturated fatty acids［J］.British Journal of Nutrition，2006，95(6):1199－1211.

［15］ CHOISH，SONG M K.Effectof C18-polyunsaturated fatty acids on their direct incorporation into the rumen bacterial lipids and CLA production in vitro［J］.Asian-Australasian Journal of Animal Sciences，2005，18(4):1011－2367.

［16］ MCDOUGALL E I.Studies on rum inant saliva.1.The composition and output of sheep’s saliva［J］.Biochem ical Journal，1948，43(1):99－109.

［17］ FOLCH J，LEES M，SLOANE STANLEY G H.A sim plemethod for the isolation and purification of total lipides from animal tissues［J］.The Journal of Biological Chem istry，1957，226(1):497－509.

［18］ LEPAGE G，ROY C C.Direct transesterification of all classes of lipids in a one-step reaction［J］.Journal of Lipid Research，1986，27(1):114－220.

［19］ 張春梅，易賢武，苑志朋，等.富含十八碳不飽和脂肪酸的植物油對體外瘤胃發(fā)酵和甲烷生成的影響［J］.畜牧與獸醫(yī)，2009，41(12):16－19.

［20］ ZHANG C M，WU Y W，YUAN Z P，et al.Effects of adding m ixtures of linoleic acid and linolenic acid w ith different proportions on rumen fermentation and methanogenesis in vitro［J］.Chinese Journal of Animal Nutrition，2008，20(2):223－227.

［21］ 劉亮.體外法研究蘋果酸和十八碳脂肪酸對瘤胃脂肪酸代謝及甲烷產(chǎn)量的影響［D］.碩士學位論文.北京:中國農業(yè)科學院，2008.

［22］ 魏宏陽，王加啟.添加游離不飽和脂肪酸或植物油對瘤胃微生物生物體外發(fā)酵及微晶纖維素降解的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2004，35(5):491－497.

［23］ 周倩，劉佩，李海霞，等.微生物合成共軛亞油酸機理的研究進展［J］.食品工業(yè)科技，2011(11):468－471，474.

［24］ SONG M K，WANG J H，SON Y S，et al.Addition effect of seed-associated or free linseed oil on the formation of cis-9，trans-11 conjugated linoleic acid and octadecenoic acid by rum inal bacteria in vitro［J］.Asian-Australasian Journal of Animal Science，2002，15(8):1115－1120.

［25］ KIM Y J，LIU R H，BOND D R，etal.Effectof linoleic acid concentration on conjugated linoleic acid production by Butyrivibrio fibrisolvens A 38［J］.Applied and Environmental M icrobiology，2000，66(12):5226－5230.

［26］ HUGHES P E，HUNTERW J，TOVE S B.Biohydrogenation of unsaturated fatty acids.Purification and properties of cis-9，trans-11-octadecadienoate reductase［J］.Journal of Biological Chem istry，1982，257(7):3643－3649.

［27］ 李香子.調控瘤胃發(fā)酵對甲烷及共軛脂肪酸(CLA，CLnA)生成機制影響研究［D］.博士學位論文.蘭州:甘肅農業(yè)大學，2009.

［28］ 郜玉婷，葉淑紅，王際輝，等.保加利亞乳桿菌利用α－亞麻酸合成共軛亞麻酸［J］.大連工業(yè)大學學報，2012，31(4):235－238.

［29］ 張春梅，苑志明，易賢武，等.亞麻酸對飼喂不同精粗比日糧的湖羊瘤胃細菌區(qū)系的影響［J］.飼料工業(yè)，2013，34(11):46－49.