不同營養(yǎng)方式對小球藻FACHB 484生長的影響及其非自養(yǎng)生長機(jī)理研究

牛海亞馬玉龍,石勛祥牛 芮

(1. 寧夏大學(xué)能源化工國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地, 寧夏 750021; 2. 寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 寧夏 750021)

不同營養(yǎng)方式對小球藻FACHB 484生長的影響及其非自養(yǎng)生長機(jī)理研究

牛海亞1馬玉龍1,2石勛祥1牛 芮1

(1. 寧夏大學(xué)能源化工國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地, 寧夏 750021; 2. 寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 寧夏 750021)

系統(tǒng)研究了小球藻FACHB 484在含有葡萄糖的不同營養(yǎng)方式下的生長情況, 并通過抑制試驗(yàn)探討葡萄糖在小球藻FACHB 484光異養(yǎng)和兼養(yǎng)生長條件下所起的作用以及小球藻FACHB 484是否存在氧化呼吸系統(tǒng)的關(guān)鍵酶類。結(jié)果表明: 小球藻FACHB 484可利用葡萄糖進(jìn)行化能異養(yǎng)、光激活異養(yǎng)、光異養(yǎng)及兼養(yǎng)生長, 其生長速率大小為: 兼養(yǎng)＞光異養(yǎng)＞光激活異養(yǎng)＞化能異養(yǎng)＞光合自養(yǎng)。兼養(yǎng)培養(yǎng)的最大生物量和比生長速率分別是自養(yǎng)培養(yǎng)的8.6和3.4倍, 其比生長速率接近于光合自養(yǎng)和光異養(yǎng)培養(yǎng)下的比生長速率之和。葡萄糖主要作為小球藻FACHB 484兼養(yǎng)和光異養(yǎng)培養(yǎng)的碳源, 而能量主要源自光。小球藻FACHB 484存在氧化呼吸鏈代謝途徑, 其細(xì)胞中有琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素氧化酶。

小球藻; 異養(yǎng)生長; 兼養(yǎng)生長; 代謝機(jī)理

小球藻(Chlorella)為綠藻門、小球藻屬的單細(xì)胞綠藻[1]。與高等植物相比, 小球藻不僅可利用光能和CO2進(jìn)行光合自養(yǎng)(Photoautotrophy)生長, 而且可以利用有機(jī)碳進(jìn)行異養(yǎng)(Heterotrophy)和兼養(yǎng)生長(Mixotrophy)[2]。光合自養(yǎng)的光抑制性是限制微藻生物量增加的主要原因之一。異養(yǎng)培養(yǎng)以外加有機(jī)碳為碳源和能源[3], 能夠降低或消除光合自養(yǎng)培養(yǎng)的不足。異養(yǎng)培養(yǎng)和兼養(yǎng)培養(yǎng)不僅能提高微藻的生物量[4], 而且微藻的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生化組分也發(fā)生了變化?？姇粤岬萚5]通過異養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞工程技術(shù)獲得了油脂含量高達(dá) 57.9%的異養(yǎng)小球藻, 使油脂含量在化合自養(yǎng)的基礎(chǔ)上提高了4倍。

目前, 關(guān)于微藻異養(yǎng)、兼養(yǎng)的生長機(jī)理還不清楚。一些微藻盡管有代謝有機(jī)碳所必須的酶系, 但對有機(jī)碳卻不能同化吸收, 如小定鞭藻(Prymnesium parvum)和杜氏鹽藻(Dunaliella tertiolecta)[6]。Gladue[7]對一些微藻沒有異養(yǎng)生長能力的原因提出了三種假說: 通透性障礙、相關(guān)酶的缺乏和限制性的呼吸能力。但不同微藻或同一種微藻不同品系間的異養(yǎng)、兼養(yǎng)生長機(jī)理可能存在差異。吳慶余等[8]對小球藻(Chlorella protothecoides)的兩種品系(中國品系C與美國品系A(chǔ))在高濃度葡萄糖、低濃度有機(jī)氮的條件下進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng), 發(fā)現(xiàn)兩株小球藻在生長速率、葉綠素含量及細(xì)胞內(nèi)腺苷酸能荷值(AEC)方面存在很大的差異性。近年來, 關(guān)于小球藻培養(yǎng)的研究報道主要集中在自養(yǎng)培養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)方面[9], 但對小球藻的自養(yǎng)、化能異養(yǎng) (Chemoheterotrophy)、光激活異養(yǎng) (Light-activated heterotrophic growth, LAHG)、光異養(yǎng) (Photoheterotrophy)和兼養(yǎng)培養(yǎng)的系統(tǒng)比較研究報道較少, 尤其在利用葡萄糖代謝機(jī)理方面的研究報道甚少。本研究針對以上兩個方面進(jìn)行試驗(yàn), 為小球藻的基礎(chǔ)研究及利用小球藻進(jìn)行生產(chǎn)研究的其他領(lǐng)域提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種

小球藻FACHB 484(Chlorella sp. 484)購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻種庫(FACHB)。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

SE基礎(chǔ)培養(yǎng)液(1L), 其配方如下: NaNO3250 mg, K2HPO475 mg, MgSO4·7H2O 75 mg, CaCl2·2H2O 25 mg, KH2PO4175 mg, NaCl 25 mg, FeCl3·6H2O 5 mg, EDTA-Fe 1 mL, Trace mental solution 1 mL,土壤提取液40 mL, 蒸餾水958 mL。

試劑: 葡萄糖, 3-(3, 4-二氯苯基)-1, 1-二甲脲(DCMU, 購于Sigma公司), 2, 4-二硝基苯酚, 疊氮化鈉, 丙二酸鈉, 頭孢噻肟鈉。

1.3 培養(yǎng)條件

將配置分裝好的培養(yǎng)基在高壓滅菌鍋中 121℃滅菌 20min, 滅菌后冷卻至室溫, 添加頭孢噻肟鈉至0.5 mg/L防止染菌。在超凈臺中將生長至對數(shù)期的微藻接種于含150 mL培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中(接種量20, v/v), 溫度30℃、平均光強(qiáng)5000 lx的培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 光暗比12h 12h∶ 。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計

小球藻 FACHB 484不同營養(yǎng)方式比較 光合自養(yǎng)培養(yǎng): 將微藻接種于SE基礎(chǔ)培養(yǎng)基中, 在光照條件下培養(yǎng)。設(shè)置三個平行, 每隔 24h測定其生物量及pH變化。兼養(yǎng)培養(yǎng): 在SE培養(yǎng)基中添加碳濃度200 mg/L的葡萄糖, 于光照條件下培養(yǎng)。設(shè)置三個平行, 每隔24h測定其生物量及pH變化?；墚愷B(yǎng): 在SE培養(yǎng)基中添加碳濃度200 mg/L的葡萄糖, 將錐形瓶用黑色布袋包裹, 于完全黑暗條件下培養(yǎng)。設(shè)置三個平行, 每隔 24h測定其生物量及pH變化。光激活異養(yǎng): 在SE培養(yǎng)基中添加碳濃度200 mg/L的葡萄糖, 將錐形瓶用黑色布袋包裹, 于完全黑暗條件下培養(yǎng), 每24h取下布袋, 以5000 lx脈沖式短波照射 10min。設(shè)置三個平行, 每隔 24h測定其生物量及pH變化。光異養(yǎng): 在SE培養(yǎng)基中添加碳濃度200 mg/L的葡萄糖, 并添加10–6mol/L 3-(3, 4-二氯苯基)-1, 1-二甲脲(DCMU), 于光照條件下培養(yǎng)。設(shè)置三個平行, 每隔 24h測定其生物量及pH變化。

兼養(yǎng)與光異養(yǎng)碳源試驗(yàn) 在自養(yǎng)、兼養(yǎng)、和光異養(yǎng)、培養(yǎng)基中分別添加5.0×10–7和5×10–5mmol/L的2, 4-二硝基苯酚(DNP), 設(shè)置三個平行, 每隔24h測定其生物量。

呼吸鏈抑制劑對小球藻FACHB 484生長的影響在自養(yǎng)和兼養(yǎng)培養(yǎng)基中分別添加0.1和1 mmol/L的丙二酸鈉, 光照培養(yǎng), 設(shè)置三個平行, 每隔24h測定其生物量。

在自養(yǎng)和兼養(yǎng)培養(yǎng)基中分別添加1和10 μmol/L的疊氮化鈉, 光照培養(yǎng), 設(shè)置三個平行, 每隔24h測定其生物量。

1.5 樣品測定

藻細(xì)胞生物量測定。采用紫外可見分光光度儀測定微藻溶液在最大吸收波長λ690處的吸光度值(A690), 并采用血球計數(shù)板計數(shù)微藻細(xì)胞個數(shù), 建立微藻細(xì)胞個數(shù)與吸光度值 A690之間的擬合曲線, 曲線方程如下:

式中y為微藻吸光度值A(chǔ)690, x為藻細(xì)胞個數(shù)。

微藻比生長速率(Specific growth rate): 微藻比生長速率是依據(jù)細(xì)胞密度值通過最小二乘法擬合得到, 用來評價微藻的日生長情況及平均比生長速率,即其在一定時期內(nèi)的總體生長情況。公式如下[10]:

式中μ為微藻比生長速率(/d), N0為接種時微藻細(xì)胞密度, NT為培養(yǎng)T天后微藻細(xì)胞密度, ΔT為微藻接種到T天時的時間間隔。

2 結(jié)果

2.1 小球藻FACHB 484營養(yǎng)方式比較

由圖1可知: 小球藻FACHB 484能利用葡萄糖進(jìn)行化能異養(yǎng)、光激活異養(yǎng)、光異養(yǎng)和兼養(yǎng)生長。在化能異養(yǎng)和光激活異養(yǎng)條件下, 小球藻 FACHB 484顏色依然為綠色, 但生長緩慢。在添加了DCMU的光異養(yǎng)條件下小球藻 FACHB 484生長狀況優(yōu)于化能異養(yǎng)和光激活異養(yǎng), 但在培養(yǎng) 12d以后因葡萄糖耗盡而死亡。小球藻FACHB 484在兼養(yǎng)條件下的生長狀況最好。并且所試微藻兼養(yǎng)比生長速率(0.33)與光合自養(yǎng)比生長速率(0.13)和光異養(yǎng)比生長速率(0.19)之和(0.32)非常接近, 說明小球藻FACHB 484兼養(yǎng)培養(yǎng)比生長速率等于光異養(yǎng)培養(yǎng)與自養(yǎng)培養(yǎng)比生長速率之和。

2.2 在不同營養(yǎng)方式下小球藻FACHB 484體系pH變化

圖1 小球藻FACHB 484在不同營養(yǎng)方式下的生長情況Fig. 1 The growth performance of Chlorella sp. FACHB 484 under different trophic conditions

圖2 小球藻FACHB 484在不同營養(yǎng)方式下體系pH變化Fig. 2 The change of medium pH of Chlorella sp. 484 under different trophic conditions

由圖2可知: 小球藻FACHB 484在加入葡萄糖進(jìn)行化能異養(yǎng)、光激活異養(yǎng)、光異養(yǎng)和兼養(yǎng)生長時,體系pH都首先有一個小幅的下降, 之后又升高, 且升高的幅度與小球藻 FACHB 484生物量增加的幅度相一致。而在自養(yǎng)生長條件下, 小球藻 FACHB 484體系pH保持了一個小幅的波動上升趨勢。推測小球藻FACHB 484在利用葡萄糖生長的初期, 代謝產(chǎn)生了一些小分子的酸類物質(zhì)[11]。之后由于葡萄糖濃度下降, SE培養(yǎng)基中NaNO3為一種生物性堿,隨著微藻細(xì)胞對3NO?的吸收, 培養(yǎng)基中 Na+過剩,微藻細(xì)胞泵出的OH–占優(yōu)勢, 使溶液pH不斷升高,而在光合自養(yǎng)生長過程中微藻生長緩慢, 且由于藻液中晝夜CO2含量的不同, 使pH保持了一個小幅波動上升的趨勢。小球藻FACHB 484能夠利用葡萄糖進(jìn)行化能異養(yǎng)、光激活異養(yǎng)、光異養(yǎng)和兼養(yǎng)生長, 說明小球藻FACHB 484中存在一些正常代謝的酶類。

2.3 兼養(yǎng)與光異養(yǎng)碳源試驗(yàn)

圖3 2, 4-二硝基苯酚對不同培養(yǎng)方式下小球藻FACHB 484生長的影響Fig. 3 Effects of 2, 4-dinitrophenol on the growth of Chlorella sp. FACHB 484 under different conditions

上述研究表明: 小球藻FACHB 484能利用葡萄糖進(jìn)行化能異養(yǎng)、光激活異養(yǎng)、光異養(yǎng)和兼養(yǎng)生長,為了進(jìn)一步探明葡萄糖在小球藻 FACHB 484光異養(yǎng)和兼養(yǎng)生長中的作用, 本實(shí)驗(yàn)以DNP為解偶聯(lián)劑,對葡萄糖光異養(yǎng)培養(yǎng)和兼養(yǎng)培養(yǎng)條件下的小球藻FACHB 484生長狀況進(jìn)行研究。從圖3中可知, 在光異養(yǎng)培養(yǎng)和兼養(yǎng)培養(yǎng)條件下, 添加5×10–7和5× 10–5mmol/L DNP對小球藻FACHB 484生長未產(chǎn)生顯著影響。

2.4 呼吸鏈抑制劑對小球藻FACHB 484生長的影響

大多數(shù)微藻為光合自養(yǎng)生物, 但許多微藻也能利用有機(jī)碳進(jìn)行兼養(yǎng)和異養(yǎng)生長。只有少數(shù)微藻可以在完全黑暗的條件下利用有機(jī)碳進(jìn)行異養(yǎng)生長。本試驗(yàn)已證明小球藻FACHB 484能夠利用葡萄糖進(jìn)行生長。為了進(jìn)一步驗(yàn)證小球藻FACHB 484是否存在呼吸代謝途徑和末端氧化系統(tǒng)的酶, 采用丙二酸鈉和疊氮化鈉對小球藻FACHB 484進(jìn)行抑制試驗(yàn)。由圖4、圖5可知, 在自養(yǎng)培養(yǎng)和兼養(yǎng)培養(yǎng)條件下, 小球藻FACHB 484對丙二酸鈉和疊氮化鈉的抑制都敏感, 隨抑制劑濃度的增加, 抑制效果明顯增強(qiáng)。

圖4 丙二酸鈉對小球藻FACHB 484生長的影響Fig. 4 Effects of sodium malonate on the growth of Chlorella sp. FACHB 484

圖5 疊氮化鈉對小球藻FACHB 484生長的影響Fig. 5 Effects of sodium azide on the growth of Chlorella sp. FACHB 484

3 討論

許多微藻具有利用有機(jī)碳進(jìn)行兼養(yǎng)和異養(yǎng)生長的能力, 如魚腥藻HB1017能利用果糖、葡萄糖和蔗糖為底物進(jìn)行化能異養(yǎng)生長[12,13]。集胞藻 (Synechocystis sp.) PCC6803可以在每天一個短時光照(5min)條件下利用葡萄糖進(jìn)行光激活異養(yǎng)[14,15], 三角褐指藻具有兼養(yǎng)生長的能力[16]。本試驗(yàn)對小球藻FACHB 484進(jìn)行了自養(yǎng)、兼養(yǎng)和異養(yǎng)的系統(tǒng)試驗(yàn)。結(jié)果表明, 在含葡萄糖的培養(yǎng)基中, 小球藻 FACHB 484在不同營養(yǎng)方式下的生長情況為: 兼養(yǎng)生長>光異養(yǎng)生長>光激活異養(yǎng)生長>化能異養(yǎng)生長>光合自養(yǎng)(圖1)。在光異養(yǎng)條件下培養(yǎng)小球藻FACHB 484, 12d以后死亡, 是由于DCMU是光合作用抑制劑, 在培養(yǎng)基中加入 DCMU以后,微藻細(xì)胞光系統(tǒng)Ⅱ的活性被抑制, 阻斷了非環(huán)式電子傳遞, NADPH不再產(chǎn)生, CO2不能被微藻同化吸收[17—19]。所以當(dāng)葡萄糖被耗盡時, 如不再添加碳源,微藻細(xì)胞由于缺少生長所必須的碳源而死亡。文獻(xiàn)報道, 大多數(shù)微藻兼養(yǎng)的比生長速率等于異養(yǎng)培養(yǎng)與自養(yǎng)培養(yǎng)比生長速率之和(μ兼養(yǎng)=μ異養(yǎng)+μ自養(yǎng)), 兼養(yǎng)培養(yǎng)兼有光合自養(yǎng)與異養(yǎng)代謝的性質(zhì), 在光合自養(yǎng)條件下, CO2作為唯一碳源維持微藻生長, 在光異養(yǎng)條件下, 非環(huán)式電子傳遞被阻斷, CO2不能被同化吸收,微藻只能利用有機(jī)碳進(jìn)行生長。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明, 小球藻FACHB 484兼養(yǎng)的比生長速率等于光合自養(yǎng)培養(yǎng)與光異養(yǎng)培養(yǎng)比生長速率之和, 兼養(yǎng)培養(yǎng)是獲得小球藻FACHB 484高密度、高產(chǎn)量、短周期培養(yǎng)的最佳營養(yǎng)方式。

本實(shí)驗(yàn)以DNP為解偶聯(lián)劑, 進(jìn)一步探明葡萄糖在小球藻FACHB 484光異養(yǎng)和兼養(yǎng)生長中的作用。生物體的磷酸化有代謝連接的磷酸化和呼吸鏈連接的磷酸化兩種類型, 即底物水平磷酸化和氧化磷酸化。氧化磷酸化的作用是有機(jī)物在分解過程中釋放的能量用于ATP的合成。DNP是一種疏水性質(zhì)子載體, 作為氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑, DNP能輕易擴(kuò)散穿過線粒體內(nèi)膜, 以質(zhì)子化的形式將膜間隙的H+帶回線粒體并釋放到基質(zhì)中, 從而消除了線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的H+濃度梯度, 破壞了激活A(yù)TP合成酶的質(zhì)子驅(qū)動力[20], ATP不能被合成, 使氧化和磷酸化脫偶聯(lián), 氧化釋放的能量全部以熱的形式散發(fā)。DNP對小球藻FACHB 484生長未產(chǎn)生顯著影響(圖3), 因此可以排除小球藻 FACHB 484在光異養(yǎng)和兼養(yǎng)培養(yǎng)條件下主要通過葡萄糖氧化磷酸化提供能量的途徑。這說明小球藻FACHB 484在光異養(yǎng)和兼養(yǎng)培養(yǎng)條件下的能量來源是光, 而葡萄糖主要為小球藻FACHB 484生長起提供碳源的作用。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證小球藻 FACHB 484是否存在呼吸代謝途徑和末端氧化系統(tǒng)的酶, 采用丙二酸鈉和疊氮化鈉對小球藻FACHB 484進(jìn)行抑制試驗(yàn)。琥珀酸脫氫酶是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一, 具有嚴(yán)格的立體專一性。丙二酸是琥珀酸的類似物, 是琥珀酸脫氫酶的強(qiáng)有力的競爭性抑制物,可以阻斷三羧酸循環(huán)。細(xì)胞色素氧化酶是電子傳遞鏈末端的酶。細(xì)胞色素aa3和P450輔基中的鐵原子可以與疊氮化合物形成一個配位鍵, 阻斷呼吸鏈的電子傳遞。小球藻FACHB 484對丙二酸鈉和疊氮化鈉的抑制都敏感, 隨抑制劑濃度的增加, 抑制效果明顯增強(qiáng)(圖4、圖5)。這說明小球藻FACHB 484線粒體內(nèi)膜存在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)。因此可見, 小球藻FACHB 484中存在氧化呼吸系統(tǒng)的一些關(guān)鍵酶系。

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STUDY ON THE EFFECTS OF DIFFERENT NUTRITION MODES ON THE GROWTH OF CHLORELLA SP. FACHB 484 AND THE MECHANISM OF HETEROTROPHIC GROWTH

NIU Hai-Ya1, MA Yu-Long1,2, SHI Xun-Xiang1and NIU Rui1
(1. State Key Laboratory Cultivation Base of Energy Resources & Chemical Engineering, Ningxia University, Yinchuan 750021, China; 2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Ningxia University, Yinchuan 750021, China)

Here we systematically studied the growth of Chlorella sp. FACHB 484 in glucose-containing medium in different nutrition modes. We also conducted the inhibition tests to investigate the effects of glucose on the growth of Chlorella sp. FACHB 484 in heterotrophic and mixotrophic conditions, as well as to identify the key enzyme in oxidation respiratory system. We observed that Chlorella sp. FACHB 484 could utilize glucose as the source of nutrition in all the test nutritional modes and showed different growth rates in the order mixotrophy > photoheterotrophy > light-activated heterotrophy > chemoheterotrophy > photoautotrophy. The maximum biomass and specific growth rate (SGR) of the tested algae in mixotrophy were 8.6 and 3.4 times higher than those in photoautotrophy. The value of SGR of Chlorella sp. FACHB 484 in mixotrophy was close to the sum of the values of SGRs in photoautotrophy and photoheterotrophy. In mixotrophic and photoheterotrophic modes, Chlorella sp. FACHB 484 used glucose and light as the sources of carbon and energy respectively. The cells of Chlorella sp. FACHB 484 expresses succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase which are most likely the key enzymes of the oxidation respiratory chain.

Chlorella sp.; Heterotrophic growth; Mixotrophic growth; Metabolic mechanism

S968; Q949.2

A

1000-3207(2014)03-0474-06

10.7541/2014.67

2013-01-28;

2013-10-17

國家973計劃前期研究專項(xiàng)(No. 2012CB723106); 寧夏環(huán)境科學(xué)研究項(xiàng)目(No. 20100803)資助

牛海亞(1987—), 女, 寧夏固原人; 碩士研究生; 主要研究方向?yàn)樯镔|(zhì)能源。E-mail: bixinyuhu@qq.com

馬玉龍(1966—), 男, 回族, 博士后, 教授; 主要研究方向?yàn)樯镔|(zhì)冶煉與高值轉(zhuǎn)化。E-mail: nxylma@163.com