鄧 園宋 娜劉 名高天翔

(1. 中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所, 青島 266003; 2. 山東省海洋生物研究院, 青島 266002)

基于線粒體DNA Cyt b序列的雙齒圍沙蠶群體遺傳多樣性分析

鄧 園1宋 娜1劉 名2高天翔1

(1. 中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所, 青島 266003; 2. 山東省海洋生物研究院, 青島 266002)

雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis)俗稱紅蟲, 隸屬于多毛綱(Polychaeta)、沙蠶亞科(Nereidinae)、圍沙蠶屬(Perinereis), 是我國潮間帶河口泥沙灘上的優(yōu)勢種, 體大且肥, 可做餌料, 也是我國沿海河口增養(yǎng)殖種類之一。該種為熱帶、亞熱帶的廣布種, 分布于韓國、泰國、菲律賓、印度、印度尼西亞以及我國近海[1]。近年來隨著沙蠶的采捕量增大及環(huán)境變化, 導致沙蠶資源逐漸匱乏, 影響到其資源的可持續(xù)利用與發(fā)展[2]。

分子標記是物種遺傳差異的表現(xiàn), 可以用來有效檢測物種遺傳多樣性和遺傳結構[3,4]。在所有的分子標記中,線粒體DNA具有嚴格遵守母系遺傳、幾乎不發(fā)生重組、進化速度快等特征, 已被廣泛應用于種間水平和種內(nèi)水平物種遺傳多樣性及遺傳結構研究[5]。而線粒體DNA Cyt b在無脊椎動物中, 具有較高的核苷酸替代速率, 是研究群體水平遺傳多樣性比較理想的分子標記[6]。目前為止,線粒體DNA Cyt b基因已被應用于刺沙蠶屬(Neanthes)、荷沙蠶屬(Hediste)、Marenzelleria等海洋多毛類的遺傳多樣性和遺傳結構的研究[7,8]。除此之外, DNA序列中的多態(tài)數(shù)量和分布模式也可為推測種群歷史提供動態(tài)信息,進而探討其產(chǎn)生和維持的機制[6,9]。

到目前為止, 對雙齒圍沙蠶的研究主要集中在其生活史、性腺發(fā)育的組織學、生態(tài)和生態(tài)因子對其早期發(fā)育的影響等方面[10—13]。種群遺傳學方面僅有Liu, et al.基于線粒體DNA COⅠ部分片段研究了雙齒圍沙蠶4個群體的遺傳多樣性及遺傳結構現(xiàn)狀[14], 蔣霞敏等進行了雙齒圍沙蠶遺傳多樣性的隨機擴增多態(tài)分析[15]。迄今, 未見其他關于雙齒圍沙蠶遺傳多樣性研究的報道。開展雙齒圍沙蠶種質資源遺傳學研究對合理保護及開發(fā)這一重要經(jīng)濟物種具有極其重要的意義。

多毛綱大多數(shù)沙蠶種類在性成熟時, 在一定時期內(nèi)同步地離開棲息地, 由底棲起浮于海面游動以排精放卵,此生殖習性稱為群浮[16]。雙齒圍沙蠶的的群浮現(xiàn)象多出現(xiàn)在每年的4月下旬至10月下旬, 雌雄蟲常相伴做圓形的旋轉游動, 在旋轉纏繞過程中排精放卵。沙蠶的群浮保證精卵相遇而受精, 自由浮游的沙蠶幼蟲, 可隨潮流或海流達遠而廣的分布[1]。沙蠶的群浮現(xiàn)象可能會影響多毛類群體的遺傳結構及遺傳多樣性[7]。本研究基于線粒體DNA Cyt b分子標記對采自中國東營和青島的雙齒圍沙蠶進行遺傳學研究, 以闡明其群體遺傳結構和遺傳多樣性現(xiàn)狀, 探討其產(chǎn)生原因和維持機制, 為雙齒圍沙蠶的資源保護及合理的資源開發(fā)提供基礎資料和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存

于2011年8月在山東青島近海潮間帶采集雙齒圍沙蠶野生群體34個個體, 于2012年5月在山東東營近海潮間帶采集雙齒圍沙蠶野生群體31個個體。經(jīng)形態(tài)鑒定以后, 取樣品體節(jié)肌肉于95%的酒精中保存?zhèn)溆谩＿x擇多齒圍沙蠶(Perinereis nuntia)作為外群進行遺傳學分析。

1.2 DNA提取與PCR擴增

取雙齒圍沙蠶肌肉組織約 100 mg采用傳統(tǒng)的酚-氯仿方法提取基因組DNA, 將乙醇沉淀后的基因組DNA溶解于100 μL雙蒸水溶液中, 4℃保存?zhèn)溆肹6]。雙齒圍沙蠶的Cyt b序列擴增引物為Cyt bF(5′-GGWTAYGTWYTWCC WTGRGGWCARAT-3′)和 Cyt bR(5′-GCRTAWGCRAAW ARRAARTAYCAYTCWGG-3′)[17], PCR反應體系總體積為25 μL, 其中包括: 10×PCR緩沖液2.5 μL, dNTP 2 μL (200 μmol/L); 兩種引物個1 μL (10 pmol/μL); TaqDNA聚合酶0.15 μL (5 U/μL); 模板DNA 1 μL; 加雙蒸水至總體積25 μL。PCR反應條件如下: 94℃預變性5min, 然后進行35個循環(huán), 每個循環(huán)包括94℃變性45s, 50℃退火45s, 72℃延伸45s, 最后72℃延伸10min。所有的PCR反應均在Eppendorf (Mastercycler 5333)擴增儀上進行[18]。

取1.5 μL PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測, 對于擴增效果良好的樣品進行回收?；厥諘r用 1.5%的瓊脂糖凝膠, 150V電壓電泳分離, 用小量膠回收試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)進行回收和純化。將純化后的產(chǎn)物送往上海桑尼生物科技有限公司進行測序, 為保證所測序列的準確性, 每個樣品均進行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對兩個群體的序列用DNAStar(DNASTARInc)軟件進行比對, 并輔以人工校正; 用 MEGA4.1軟件分析兩群體的堿基組成、變異位點、轉換/顛換值; 運用 PAUP和 Modeltest軟件計算得到適合雙齒圍沙蠶 Cyt b片段的核苷酸最佳替換模型; 采用PAUP軟件, 以多齒圍沙蠶為外群, 構建雙齒圍沙蠶鄰近關系樹。采用 Arlequin3.0軟件計算群體遺傳學參數(shù); 單倍型多樣度(h)、核苷酸多樣度(л)和兩兩序列比對平均核苷酸差異數(shù)(k); 進行確切P檢驗,并計算兩個群體間的Fst值檢驗群體遺傳分化。采用中性檢驗和核苷酸不配對分布分析兩種方法檢測群體歷史動態(tài), 上述兩種方法均在Arlequin3.0軟件中完成。

2 結果

對雙齒圍沙蠶東營和青島共65個個體進行PCR擴增得到長度為375 bp的序列片段, 基于Cyt b序列對兩個群體進行比較分析結果顯示: 青島群體34個個體共檢測到20個多態(tài)位點, 這些多態(tài)位點共定義了20處核苷酸替換, 包括 18處轉換和 2處顛換, 共定義了20個單倍型;東營群體31個個體共檢測到13個多態(tài)位點, 這些多態(tài)位點共定義了13處核苷酸替換, 包括9處轉換和4處顛換,共定義了14個單倍型。青島群體的單倍型多樣度、核苷酸多樣度以及兩兩序列比較的平均堿基差異數(shù)均大于東營群體(表 1)。兩個群體的 A+T堿基含量(63.7%)都明顯大于 C+G含量(36.4%), 且無明顯差異。通過 PAUP和Modeltest軟件計算得到雙齒圍沙蠶最佳替換模型為HKY+I+G(I=0.8821, G=1.0392)。

以多齒圍沙蠶為外群, 基于雙齒圍沙蠶青島和東營群體Cyt b序列構建的鄰接關系樹可以看出, 青島和東營群體個體相互混雜, 且有共享單倍型, 兩群體的單倍型都廣泛的分布在單倍型的鄰接關系樹上, 沒有明顯的分支與之對應(圖1)。兩個群體之間的遺傳分化指數(shù)Fst值為0.0175, 統(tǒng)計檢驗 P值為不顯著(P=0.0966), 表明兩個群體之間的遺傳差異不顯著, 確切 P檢驗的結果表明兩群體存在隨機交配的現(xiàn)象(P=0.1182)。

表1 雙齒圍沙蠶的遺傳多樣性參數(shù)Tab.1 Molecular diversity indices for P. aibuhitensis based mtDNA Cyt b

雙齒圍沙蠶核苷酸不配對分布呈單峰狀態(tài)(圖2), 且觀測值沒有明顯偏離模擬值, Fs和D中性檢驗的結果與核苷酸不配對分布分析的結果也是一致的(Tajima’ D=–1.9136, P=0.005; Fs= –27.0956, P=0.0000), 都顯著偏離中性, 提示雙齒圍沙蠶經(jīng)歷過近期群體擴張事件。核苷酸不配對分布的峰值 τ提供了一個估算群體大致發(fā)生擴張的時間, 將每百萬年2%—5%的Cyt b進化速率應用于本研究[19], 基于核苷酸不配對分布的τ值(τ=2.62109)計算得到雙齒圍沙蠶群體擴張時間在130000—69000YBP。

圖1 以多齒圍沙蠶為外群構建的雙齒圍沙蠶Cyt b單倍型鄰接關系樹Fig. 1 Neighbor-joining tree for control region haplotypes of P. aibutitensis and P. nuntia served as an outgroup

圖2 雙齒圍沙蠶線粒體Cyt b單倍型核苷酸不配對分布圖Fig. 2 Mismatch distribution analyses of nucleotide of mtDNA Cyt b genes for P. anbutitensis populations

3 討論

物種遺傳多樣性水平的高低與其適應能力、生存能力和進化潛力存在密切的相關性[6,19]。物種遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富, 對環(huán)境變化的適應能力就越強[20];反之, 具有較低遺傳多樣性的物種則更容易受到環(huán)境變化的影響[6,21]。目前, 對一些海洋無脊椎動物研究表明,海洋無脊椎動物的幼體發(fā)育模式和浮游能力對其遺傳結構及其遺傳多樣性的影響也是非常顯著的[22,23]。因此對物種遺傳多樣性的研究, 除了可以研究物種的進化歷史,也可以為分析物種的進化潛力和預測物種發(fā)展動向提供重要的依據(jù)[6]。

更新世冰期劇烈的氣候變化對很多物種的分布范圍造成了巨大影響[3—6], 冰期海平面下降而成為陸地, 冰盛期海平面下降了約120—140 m, 中國沿海的淺海陸架區(qū)也因海平面下降而成為陸地, 將亞洲大陸與太平洋隔離[24—26]。雙齒圍沙蠶的棲息地環(huán)境受到了極大的影響, 在其分布范圍內(nèi)棲息地急劇縮減, 隨著間冰期的氣溫回升和海平面上升, 雙齒圍沙蠶可能發(fā)生群體擴張事件[6], 而核苷酸不配對分布的單峰也提示雙齒圍沙蠶可能經(jīng)歷了近期的群體擴張事件。本研究中雙齒圍沙蠶發(fā)生群體擴張事件的時間在 130000—69000YBP, 這一時間處于晚更新世冰期,提示更新世冰期的氣候變化對雙齒圍沙蠶的數(shù)量和分布可能產(chǎn)生過影響[6]。

除歷史因素的影響, 多毛類的生活史特征對其群體遺傳多樣性及遺傳結構的影響也是很重要的。Breton, et al.基于線粒體DNA COⅠ和Cyt b分析了北半球分布的兩種沙蠶(Neanthes virens and Hediste diversicolor), 結果顯示沙蠶的群浮現(xiàn)象及浮游期影響其種群的遺傳結構[7]。雙齒圍沙蠶在性成熟之后會變成異沙蠶體, 并從底棲生活改為浮游, 快速游動一定時間后, 產(chǎn)卵排精。雙齒圍沙蠶的群浮周期與水溫、潮汐和晝夜變化等外界條件緊密相關[11]。這些外界條件都可以間接的影響雙齒圍沙蠶不同地理群體之間的基因交流。自由浮游的沙蠶幼蟲, 可隨潮流或海流達遠而廣的分布[1]。且雙齒圍沙蠶的的異沙蠶體多出現(xiàn)在每年夏季風盛行的時候[27], 沙蠶幼蟲在中國沿岸流的輸送下, 由北向南廣泛分布。因此, 海洋環(huán)流對雙齒圍沙蠶群體之間的基因交流有很重要的作用。研究得出青島群體的雙齒圍沙蠶的單倍型多樣度和核苷酸多樣度略高于東營群體, 這與青島膠州灣的復雜的地形地貌以及海流狀況可能存在一定關系[14]。

在Liu, et al.的研究中, 基于線粒體COⅠ序列在4個地理群體的93個個體中, 共檢測到26個單倍型。在本研究中, 基于線粒體Cyt b序列在2個地理群體的65個個體中共檢測到30個單倍型。提示雙齒圍沙蠶的線粒體Cyt b片段可能較 COⅠ片段更敏感, 更適合用于群體遺傳分化研究[7, 8]。

總之, 更新世冰期的氣候變化對現(xiàn)有雙齒圍沙蠶的群體遺傳結構產(chǎn)生了重要的影響, 而幼體的擴散能力促進了不同群體間的基因交流。隨著資源的開發(fā)利用, 雙齒圍沙蠶可能會承受較大的采捕壓力, 本研究對其制定合理的管理策略提供了一定的理論依據(jù)[26]。

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POPULATION GENETIC ANALYSIS OF PERINEREIS AIBUHITENSIS BASED ON THE MITOCHONDRIAL DNA CYT B

DENG Yuan1, SONG Na1, LIU Ming2and GAO Tian-Xiang1
(1. Institute of Evolution & Marine Biodiversity, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Marine Biology Institute of Shandong Province, Guizhou Road 47, Qingdao 266002, China)

雙齒圍沙蠶; Cyt b; 群體遺傳結構; 遺傳多樣性; 群體擴張

Perinereis aibuhitensis; mtDNA Cyt b; Genetic structure; Genetic diversity; Population expansion

Q346.5

A

1000-3207(2014)03-0597-05

10.7541/2014.85

2013-9-24;

2013-12-28

海洋公益性行業(yè)科研專項(201305043; 201405010); 山東省海洋與漁業(yè)廳科技計劃項目資助

鄧園(1987—), 女, 河南省湯陰縣人, 碩士; 主要從事水生生物系統(tǒng)發(fā)育與遺傳多樣性研究。E-mail: 765071558@qq.com

高天翔, E-mail: gaozhang@ouc.edu.cn