姚金科等

[摘要] 目的 篩查非毒性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫（NTNG）相關(guān)基因，探討NTNG發(fā)生機(jī)制。 方法 分別抽提NTNG患者甲狀腺組織及正常甲狀腺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)以Cy5和Cy3標(biāo)記的探針與基因表達(dá)譜芯片進(jìn)行雜交，掃描芯片熒光信號(hào)圖像，用對(duì)掃描圖像進(jìn)行數(shù)字化處理和分析。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)篩選出的部分表達(dá)差異明顯的基因進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果 篩選出表達(dá)差異明顯的基因48個(gè)，其中NTNG組中表達(dá)上調(diào)的基因36條，表達(dá)下調(diào)的基因12條。熒光定量PCR結(jié)果與基因芯片一致。 結(jié)論 NTNG患者甲狀腺組織與正常甲狀腺組織之間存在明顯的基因表達(dá)差異，為NTNG患者提供相當(dāng)數(shù)量的與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子、受體信號(hào)轉(zhuǎn)細(xì)胞信號(hào)傳遞等相關(guān)的差異表達(dá)基因，為NTNG早期診斷和治療提供了線索。

[關(guān)鍵詞] 寡核苷酸序列分析；非毒性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫；基因；差異表達(dá)

[中圖分類號(hào)] R581.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）01-27-04

非毒性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫（nontoxic nodular goiter，NTNG）是一種常見的甲狀腺疾病，發(fā)病率可高達(dá)6%～7%。以女性多見。與正常的甲狀腺細(xì)胞相比，非毒性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的甲狀腺細(xì)胞在DNA、RNA水平上應(yīng)有差異。利用這三方面的指標(biāo)的差異，研究非毒性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫表達(dá)存在差異的相關(guān)基因的變化，有助于闡明其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制?，F(xiàn)利用基因芯片技術(shù)，初步研究分析篩選NTNG患者甲狀腺組織及正常甲狀腺組織之間差異表達(dá)的基因。

1 材料與方法

1.1 材料

所有標(biāo)本均取自增城市人民醫(yī)院2009年10月～2011年10月住院患者，年齡（38.3±8.3）歲。NTNG患者共10例（男4例，女6例）。正常對(duì)照10例取自無(wú)甲狀腺病變患者的正常甲狀腺組織（男7例，女3例）。均經(jīng)病理確診。將手術(shù)切除甲狀腺標(biāo)本立即凍存于液氮中。Trizol試劑盒（Invitrogen公司），BiostarH-I DNA芯片（上海聯(lián)合基因公司），ScanArray 3000掃描儀（General Scanning公司），實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（日本TaKaRa公司），5700型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)PE公司）。

1.2 總RNA抽提

總RNA抽提將每位NTNG患者甲狀腺組織及正常甲狀腺組織樣本取100mg分別合并?？俁NA提取按Trizol試劑盒操作指南進(jìn)行。測(cè)定A260/A280，范圍在1.8～2.0。用瓊脂糖凝膠電泳（5.0V/cm，0.5h）檢測(cè)總RNA質(zhì)量，28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的2倍以上。

1.3 基因芯片

BiostarH-I DNA芯片，購(gòu)自上海聯(lián)合基因公司，該芯片共含基因1152條，其中1068條有效基因，48條管家基因， 20條內(nèi)參基因，陰性對(duì)照及空白對(duì)照各8條，內(nèi)容涉及細(xì)胞凋亡、原癌基因、受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面。

1.4 探針制備

將NTNG甲狀腺組織和正常甲狀腺組織總RNA分別逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為探針以備與基因芯片雜交。探針的合成：用Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶，以及標(biāo)記Cy5和Cy3的dUTP將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（其中Cy5用于標(biāo)記NTNG甲狀腺組織，Cy3標(biāo)記正常甲狀腺組織）。乙醇沉淀后溶解在20μL 5×SSC和0.2%SDS雜交液中。

1.5 雜交及洗滌

將雜交探針和基因芯片分別在95℃水浴中變性5min，然后將探針加在芯片上，用蓋玻片封片；再置于雜交箱，60℃，雜交15～17h；然后揭開蓋玻片，最后分別用2×SSC和0.2%SDS，0.1×SSC和0.2%SDS，0.1×SSC 洗滌10min，室溫28℃晾干。

1.6 檢測(cè)與分析

用ScanArray 3000掃描儀對(duì)雜交及洗滌制備良好的芯片進(jìn)行掃描，將所得Cy5/Cy3圖像，過濾背景噪聲后，再提取基因表達(dá)的熒光信號(hào)強(qiáng)度值。應(yīng)用ImaGene3.0軟件分析Cy3、Cy5兩種熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值。提取預(yù)先選定的內(nèi)參照基因的Cy3和Cy5的原始熒光信號(hào)，然后進(jìn)行均衡和標(biāo)準(zhǔn)化處理修正，數(shù)據(jù)小于800的Cy3、Cy5信號(hào)均剔除。判斷基因差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)：（1）Cy3和Cy5信號(hào)值其中之一必須大于800；（2）Cy3和Cy5信號(hào)比值的自然對(duì)數(shù)的絕對(duì)值（Ratio） >0.69（基因表達(dá)變化在2倍以上）。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量

PCR檢測(cè)MMP-9、p27的表達(dá)：采用嵌合熒光檢測(cè)法，按照5700型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀及實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（日本TaKaRa公司）的操作說(shuō)明進(jìn)行。采用50μL 反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTM （2×）25μL；PCR Forward Primer 2 μL；PCR Reverse Primer 2μL；ROX Reference Dye（50×）1μL；模板cDNA 4μL；以去離子水補(bǔ)足50μL設(shè)置反應(yīng)條件。主要步驟：（1）預(yù)變性：95℃，30sec，1循環(huán)；（2）PCR：95℃ 5sec，60℃ 20sec，共40個(gè)循環(huán)；（3）融解曲線分析：95℃ 0sec，65℃ 15sec，95℃ 0sec。每個(gè)標(biāo)本均平行擴(kuò)增5管，包括MMP-9、p27和β-actin。每次擴(kuò)增均制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以MMP-9，p27和β-actin的CT比值作為其相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。采用成組設(shè)計(jì)兩樣本t檢驗(yàn)比較NTNG甲狀腺組織和正常甲狀腺組織的MMP-9、p27相對(duì)表達(dá)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 基因表達(dá)譜分析結(jié)果endprint

Cy3熒光信號(hào)和Cy5熒光信號(hào)分別標(biāo)記正常甲狀腺組織和NTNG甲狀腺組織并分別以綠色和紅色表示，對(duì)于某一點(diǎn)的兩種疊加熒光信號(hào)，如果Cy3信號(hào)較強(qiáng)呈下調(diào)趨勢(shì)，該點(diǎn)多顯綠色；如果Cy5信號(hào)較強(qiáng)呈上調(diào)趨勢(shì)，該點(diǎn)多顯紅色；如果強(qiáng)度相似，即顯示黃色。通過基因表達(dá)譜比較發(fā)現(xiàn)正常甲狀腺組織和NTNG甲狀腺組織基因表達(dá)差異2倍以上共有48條，表達(dá)上調(diào)有36條，下調(diào)12 條。其中表達(dá)上調(diào)的有：MMP-9、 Akt、AnnexinⅡ、bcl-2、Bmi-1、CK19、c-met、c-myc、COx-2、CyclinD1、Ki67、Gal-3、HBME-1、HMGB1KISS-1、MMP-2、TIMP-1、MUC1、P13K、P53 、pAkt、RARβ、Ras、S100A4、Smac、t-PA、TSGF、TSHR、VEGF-C、β-catenin、雌激素受體a亞型（ERa）、多態(tài)性上皮粘蛋白（polymorphic epithelial mucin，PEM，又名MUC1）、分化抑制蛋白-1（Id-1）、高分子量角蛋白（34βe12）、唾液酸化路易斯-X（SLeX）；下調(diào)的有：p27、Rb、NIS、APC、Caspase-7、Fas、MLH1、P21WAF1、金屬蛋白酶抑制基因RECK、磷酸化eIF4E結(jié)合蛋白1（p-4EBP1）、真核細(xì)胞翻譯起始因子4E（eIF4E）、DAPK1。

2.2 FQ-PCR鑒定MMP-9、p27的表達(dá)

NTNG甲狀腺組織的MMP-9相對(duì)表達(dá)量和正常甲狀腺組織相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；NTNG甲狀腺組織的p27相對(duì)表達(dá)量和正常甲狀腺組織相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；NTNG甲狀腺組織的MMP-9基因表達(dá)水平高于正常甲狀腺組，NTNG甲狀腺組織的p27基因表達(dá)水平低于正常甲狀腺組，與基因芯片結(jié)果是一致，詳見表1。

3 討論

非毒性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫是一種分布廣泛的世界性疾病，發(fā)病率可高達(dá)6%～7%[1-2]，以女性多見。NTNG伴發(fā)甲狀腺癌一向受到重視，其發(fā)生率可高達(dá)4.0%～17.0%[3]。盡管如此，NTNG中存在甲狀腺癌已是不爭(zhēng)的事實(shí)。研究者普遍認(rèn)為，NTNG的致病機(jī)制與激素、生長(zhǎng)因子和甲狀腺濾泡的功能異質(zhì)性等因素有關(guān)。但這些研究多是從某一方面的，指標(biāo)比較單一，具有一定的局限性。基因芯片（Gene chip）技術(shù)特點(diǎn)是高通量、高集成、微型化和自動(dòng)化。目前基因芯片已被廣泛應(yīng)用于腫瘤[4-10]、代謝[11-12]、藥物治療等領(lǐng)域的研究中，尤其在腫瘤研究中得到更為廣泛的應(yīng)用，推動(dòng)了腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制的研究，在甲狀腺癌中已有學(xué)者進(jìn)行了初步研究[13-15]。本研究利用基因芯片研究發(fā)現(xiàn)，在NTNG與正常甲狀腺組織之間存在較多的表達(dá)差異明顯的基因。其中顯著差異表達(dá)基因共有48條，表達(dá)上調(diào)有36條，下調(diào)12 條。表達(dá)上調(diào)的有：MMP-9、 Akt、AnnexinⅡ、bcl-2、Bmi-1、CK19、c-met、c-myc、COx-2、CyclinD1、Ki67、Gal-3、HBME-1、HMGB1KISS-1、MMP-2、TIMP-1、MUC1、P13K、P53 、pAkt、RARβ、Ras、S100A4、Smac、t-PA、TSGF、TSHR、VEGF-C、β-catenin、雌激素受體a亞型（ERa）、多態(tài)性上皮黏蛋白（polymorphic epithelial mucin，PEM，又名MUC1） 、分化抑制蛋白-1（d-1）、高分子量角蛋白（34βe12）、唾液酸化路易斯-X（SLeX）；下調(diào)的有：p27、Rb、NIS、APC、Caspase-7、Fas、MLH1、P21WAF1、金屬蛋白酶抑制基因RECK、磷酸化eIF4E結(jié)合蛋白1（p-4EBP1）、真核細(xì)胞翻譯起始因子4E（eIF4E）、DAPK1。其中FQ-PCR鑒定MMP-9、p27的表達(dá)，與基因芯片結(jié)果是一致。目前MMP-9在NTNG研究中很少報(bào)道，多數(shù)的研究生發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，亦有學(xué)者在良性組織的研究中發(fā)現(xiàn)MMP-9對(duì)良性病變有一定的作用。程青等[16]指出肺氣腫模型組MMP-9和TIMP-1的表達(dá)與正常對(duì)照組相比明顯增強(qiáng)，且MMP-9/TIMP-1比值失衡，結(jié)論MMP-9/TIMP-1失衡在肺氣腫形成中起重要作用。詹陽(yáng)等[17]發(fā)現(xiàn)在正常甲狀腺組織、良性甲狀腺結(jié)節(jié)和甲狀腺乳頭狀癌中MMP-9 mRNA表達(dá)隨著細(xì)胞異型性的增加呈上調(diào)的趨勢(shì)。本組在NTNG中MMP-9亦為上調(diào)。從本組研究表明NTNG發(fā)生發(fā)展可能與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子、受體信號(hào)轉(zhuǎn)細(xì)胞信號(hào)傳遞等相關(guān)的差異表達(dá)基因有關(guān)。其發(fā)生與多種因素有關(guān)，但由于研究的樣本有限，需進(jìn)一步擴(kuò)大研究。雖然有的基因其差異表達(dá)的意義還不很清楚，但為深入研究NTNG的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了有價(jià)值的線索，在尋找NTNG的發(fā)病基因及治療方面具有積極的意義。

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（收稿日期：2013-11-04）endprint