張 倩， 張加余， 董魯艷， 張紅霞， 喬延江， 盧建秋*

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102)

清開(kāi)靈注射液是由八味藥組成的大復(fù)方，含有多種化學(xué)成分，主要包括環(huán)烯醚萜類、黃酮類、有機(jī)酸類等。其中綠原酸作為有機(jī)酸類成分的代表，具有抑菌、抗病毒、解熱消炎等作用，一般被當(dāng)作金銀花藥材及制劑的定性、定量指標(biāo)。目前有關(guān)清開(kāi)靈注射液中有機(jī)酸類成分的測(cè)定大多以綠原酸為測(cè)定指標(biāo)[1-3]。然而《中國(guó)藥典》2010年版和清開(kāi)靈注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案中并沒(méi)有對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制。本課題組在前期工作中發(fā)現(xiàn)注射液及相關(guān)藥味中含有多種綠原酸類成分[4-5]，該類成分分子結(jié)構(gòu)中存在酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚，在提取、貯存過(guò)程中，受溫度、pH等的影響會(huì)通過(guò)水解和分子內(nèi)酯基遷移而發(fā)生異構(gòu)化[6-8]，導(dǎo)致該類成分制備難度較大、成本較高。而王智民課題組提出的用于多成分質(zhì)量控制的“一測(cè)多評(píng)”法[9]，克服了對(duì)照品不易得、檢測(cè)成本較高的難題，并成功應(yīng)用于丹參[10]、三黃片[11]等常用中藥及制劑的成分定量測(cè)定，同時(shí)該法被《中國(guó)藥典》2010年版采納收錄。為了更好地控制清開(kāi)靈注射液產(chǎn)品質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)質(zhì)量控制，本研究采用“一測(cè)多評(píng)”法對(duì)清開(kāi)靈注射液中6種綠原酸類成分進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)不同廠家、同一廠家不同批號(hào)的產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent 公司)；Waters2695_2998高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；R200D型電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；Millipore Synergy UV型超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)。

綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：110753-200413)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對(duì)照品(純度分別為99.3%、99.8%、99.2%、98.9%、99.3%)均購(gòu)于成都普瑞法科技有限公司；8個(gè)廠家清開(kāi)靈注射液(編號(hào)分別為F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8)，F(xiàn)6廠的11批清開(kāi)靈注射液(批號(hào)分別為211005A、211405A、210905A、211605A、211505A、212005A、211705A、211305A、211105A、211205A、211805A)，均為市售產(chǎn)品。甲酸為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 基本原理[9]在一定范圍(線性范圍)內(nèi)，成分的量(質(zhì)量或濃度)與檢測(cè)器響應(yīng)成正比，即f=W/A(W表示成分的量，A表示響應(yīng)值)。在多指標(biāo)(s，a，b…，i…)質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，可以用樣品中某一典型成分(有對(duì)照品供應(yīng)，價(jià)廉易得、穩(wěn)定性較好)為內(nèi)參物(s)，建立該成分與其他成分(a，b…，i…)之間的相對(duì)校正因子，通過(guò)相對(duì)校正因子計(jì)算其他成分的量，此即“一測(cè)多評(píng)”法(QAMS)。

相對(duì)校正因子(fsi)的計(jì)算公式為：

(1)

式中Ai為樣品中待測(cè)成分i的峰面積，Ci為質(zhì)量濃度；As為樣品中內(nèi)參物s的峰面積，Cs為質(zhì)量濃度。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 分別取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為37.20、63.60、43.20、22.20、32.80、43.20 μg/mL的混合對(duì)照品貯備液，于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存。

2.2.2 供試品溶液的配制 取各批次清開(kāi)靈注射液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò), 取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃；流動(dòng)相為0.1%甲酸水(A)-乙腈(B),線性梯度洗脫(0～15 min，0～10% B；15～22 min，10%～12% B；22～45 min，12%～18% B； 45～55 min，18%～23% B)；體積流量為0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm；進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果如圖1所示。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍 精密吸取上述混合對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋至6個(gè)不同質(zhì)量濃度(1#、2#、3#、4#、5#、6#)，進(jìn)樣分析，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)樣3次，取平均值，以質(zhì)量濃度對(duì)峰面積均值進(jìn)行回歸處理，得到6種成分的線性回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

1. 新綠原酸 2. 綠原酸 3. 隱綠原酸 4. 異綠原酸B 5. 異綠原酸A 6. 異綠原酸C1.neochlorogenic acid 2.chlorogenic acid 3.cryptochlorogenic acid 4. Isochlorogenic acid B 5. Isochlorogenic acid A 6. Isochlorogenic acid C

2.4.2 精密度考察 取同一混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各成分的峰面積，結(jié)果6種綠原酸類成分峰面積的RSD均<3%，表明儀器的精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 取同一批號(hào)清開(kāi)靈注射液(010705A)，按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分的量，結(jié)果6種綠原酸類成分的RSD均<3%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)，各成分較穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性考察 取同一批號(hào)清開(kāi)靈注射液(010705A)，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分的量，結(jié)果6種綠原酸類成分的RSD均<3%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率考察 取含有量已知的同一批號(hào)清開(kāi)靈注射液(010705A)6份，每份2.5 mL，分別精密加入新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C質(zhì)量濃度分別為17.60、9.30、15.20、3.60、1.48、4.02 μg/mL的混合對(duì)照品溶液2.5 mL，混勻，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各成分的量，結(jié)果6種成分的回收率在98.71%～102.05%。

2.5 相對(duì)校正因子的確定

2.5.1 待測(cè)成分相對(duì)校正因子的計(jì)算 根據(jù)公式(1)，以綠原酸為內(nèi)參物，分別計(jì)算其他5種成分的相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 線性關(guān)系結(jié)果

表2 相對(duì)校正因子計(jì)算結(jié)果(n=2)

2.5.2 校正因子的重現(xiàn)性考察 采用Zorbax SB-C18色譜柱，分別考察了Agilent 1100和Waters 2695_2998液相色譜系統(tǒng)；采用Agilent 1100液相色譜儀，考察了3種不同型號(hào)的色譜柱(Zorbax SB-C18、BDS Hypersil C18、Phenomenex Luna)；采用Agilent 1100液相色譜儀、Zorbax SB-C18柱，分別考察了不同柱溫(25、30、35 ℃)、不同體積流量(0.5、0.6、0.8 mL/min)對(duì)綠原酸類成分相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果各成分的相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性良好(RSD<5%)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 相對(duì)校正因子重現(xiàn)性考察結(jié)果(n=2)

2.5.3 相對(duì)校正因子的確定 根據(jù)《一測(cè)多評(píng)法建立的技術(shù)指南》[9]，綜合上述影響相對(duì)校正因子的因素，將各次試驗(yàn)獲得的相對(duì)校正因子取平均值，最終確定新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B及異綠原酸C的相對(duì)校正因子分別為0.934、0.958、0.722、1.011、0.860。

2.6 待測(cè)色譜峰的定位 本研究采用相對(duì)保留值法進(jìn)行綠原酸類成分色譜峰的定位。結(jié)果表明相對(duì)保留值的波動(dòng)較小，其RSD均小于5%，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各成分的相對(duì)保留值(n=2)

2.7 “一測(cè)多評(píng)”法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的比較 分別精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下不同廠家及同一廠家不同批次的清開(kāi)靈注射液10 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定。采用外標(biāo)法和“一測(cè)多評(píng)”法計(jì)算清開(kāi)靈注射液中6種綠原酸類成分的量，結(jié)果見(jiàn)表5～6。

表5 8個(gè)廠家注射液中的綠原酸類成分測(cè)定結(jié)果(mg·mL-1，n=2)

表6 同一廠家(F6)不同批次注射液中的綠原酸類成分測(cè)定結(jié)果(mg·mL-1，n=2)

外標(biāo)法與“一測(cè)多評(píng)”所測(cè)結(jié)果經(jīng)t檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)分析，兩種方法測(cè)得的成分量沒(méi)有顯著性差異。

8個(gè)廠家注射液中綠原酸類成分的量存在較大差異，其中異綠原酸C和異綠原酸B量的最低值與最高值相差分別達(dá)14倍和20倍之多，其他4種成分相差約7～10倍。同一廠家不同批次綠原酸類成分的量也存在一定差異，各成分量最低值與最高值相差約3～4倍。

3 討論

3.1 相對(duì)于其他5種有機(jī)酸類成分，綠原酸常作為金銀花藥材及含金銀花的中藥制劑中主要指標(biāo)性成分，且該成分比較常見(jiàn)、價(jià)廉易得，因此選取綠原酸作為內(nèi)參物，建立該成分與其他5種有機(jī)酸的相對(duì)校正因子。

3.2 采用“一測(cè)多評(píng)”法進(jìn)行多成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)，各成分相對(duì)校正因子的獲得和待測(cè)成分色譜峰的定位至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)影響相對(duì)校正因子重現(xiàn)性的儀器、色譜柱、柱溫、體積流量進(jìn)行了考察，結(jié)果均表明本實(shí)驗(yàn)所獲得的相對(duì)較正因子具有較好的可靠性。在進(jìn)行待測(cè)成分色譜峰定位時(shí)，分別對(duì)相對(duì)保留值和保留時(shí)間差進(jìn)行了考察，結(jié)果利用保留時(shí)間差進(jìn)行定位時(shí)，新綠原酸和隱綠原酸的RSD大于10%，不符合要求。但采用相對(duì)保留值結(jié)果良好，6種成分的RSD均小于5%，最終選擇相對(duì)保留值作為定位色譜峰的依據(jù)。

3.3 不同廠家的注射液中綠原酸類成分的量差異較大，可能是由于產(chǎn)品的原藥材不同或生產(chǎn)工藝不同造成的。為保證清開(kāi)靈注射液的質(zhì)量，應(yīng)對(duì)其生產(chǎn)工藝進(jìn)行統(tǒng)一，加強(qiáng)原藥材的質(zhì)量控制及中間體、成品的監(jiān)測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 曹 進(jìn), 徐 燕, 王義明, 等. 多波長(zhǎng)高效液相色譜法測(cè)定清開(kāi)靈注射液中3種有效成分[J]. 藥物分析雜志, 2004, 24(1): 8-11.

[2] 周海燕, 李 丹. 高效液相色譜法測(cè)定清開(kāi)靈注射液中綠原酸含量[J]. 中國(guó)藥業(yè), 2011, 20(1): 36-37.

[3] 武彥舒, 金 城, 張 倩, 等. 清開(kāi)靈注射液中10種有效成分的同時(shí)測(cè)定及其質(zhì)量相關(guān)性研究[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2009, 29(11): 3112-3116.

[4] 張 倩, 張加余, 隋丞琳, 等. HPLC-DAD-ESI-MS/MS研究金銀花水提工藝中綠原酸類成分的變化規(guī)律[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2012, 37(23): 14-18.

[5] Zhang Jiayu, Zhang Qian, Li Ning,etal. Diagnostic fragment-ion-based and extension strategy coupled to DFIs intensity analysis for identification of chlorogenic acids isomers inFlosLoniceraeJaponicaeby HPLC-ESI-MSn[J].Talanta, 2013, 104: 1-9.

[6] Ma Yuanchun, Wang Xiaoqian, Hou Feifei,etal. Rapid resolution liquid chromatography(RRLC) analysis and studies on the stability of Shuang-Huang-Lian preparations[J].JPharmBiomedAnal, 2011, 54(2): 265-272.

[7] Makiko T, Kazuko N, Seiichiro I,etal. Changes in caffeic acid derivatives in sweet potato (IpomoeabatatasL.) during cooking and processing[J].JPharmBiomedAnal, 2006, 70(1): 172-177.

[8] 顧利紅, 朱品業(yè). 日光和溫度對(duì)綠原酸供試液穩(wěn)定性的影響[J]. 中成藥, 1999, 21(11): 568-569.

[9] 王智民, 錢忠直, 張啟偉, 等. 一測(cè)多評(píng)法建立的技術(shù)指南[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2011, 36(6): 657-658.

[10] 李 倩, 劉 偉, 羅祖良, 等. 一測(cè)多評(píng)法測(cè)定丹參中丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、二氫丹參酮Ⅰ的含量[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2012, 37(6): 824-828.

[11] 吉麗娜, 馮偉紅, 王智民, 等.“一測(cè)多評(píng)”法與外標(biāo)法測(cè)定三黃片中4種黃芩黃酮類成分[J]. 中成藥, 2012, 34(11): 2128-2133.