巨濤 劉寧青

·綜述與講座·

Survivin與甲狀腺腫瘤及凋亡指數(shù)的研究進展

巨濤 劉寧青

survivin；甲狀腺腫瘤；凋亡指數(shù)

細胞凋亡(Apoptosis) 是一種由基因調(diào)控的高度保守的細胞主動死亡過程，這一過程受到一系列促凋亡蛋白及抑制凋亡蛋白的精確調(diào)控。細胞凋亡異常是許多惡性腫瘤顯著的生物學特征[1]。甲狀腺癌(Thyroid carcinoma TC)是最常見的頭頸部及內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，Survivin 是迄今為止最小的凋亡抑制蛋白家族的新成員。研究顯示， Survivin對凋亡的抑制可能是其參與甲狀腺癌發(fā)生的重要機制[1]。細胞凋亡指數(shù)(apoptotic index AI)作為近年來評價腫瘤細胞凋亡發(fā)生程度的一項指標，已普遍用于各種腫瘤中凋亡的檢測。本文就survivin與甲狀腺癌及其凋亡指數(shù)的研究現(xiàn)狀做簡要綜述。

1 survivin的分子生物學

1997年耶魯大學的Ambrosini等[2]利用效應細胞蛋白酶受體-1(effector cell protease receptor-1,EPR-1) cDNA 在人類基因組文庫中首先克隆出Survivin基因。其是迄今為止最小的凋亡抑制蛋白家族的新成員，卻具有最強大的抗凋亡作用。人類的Survivin基因定位于染色體17q25，由約15×103個堿基對組成，基因全長14700bp，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成。其與EPR-1 基因的編碼區(qū)序列高度互補，二者不同的是Survivin與EPR-1方向相反，序列上有5個核苷酸與EPR-1不同， 以及有額外6個插入的核苷酸。

Survivin基因外顯子和內(nèi)含子不同的選擇性剪切片段能夠轉(zhuǎn)錄出大量不同的剪接變體mRNA，進一步編碼出不同的蛋白[3]。目前發(fā)現(xiàn)的Survivin剪接變體有五種：Survivin 野生型，Survivin-2α，Survivin-2β，Survivin-3β，Survivin-ΔEx3。其在細胞中主要存在于細胞核和細胞質(zhì)，近期在線粒體也發(fā)現(xiàn)了Survivin的存在。Survivin3β和SurvivinΔEx3 均有抗凋亡特性。有研究顯示，Survivin2β的缺失可導致腫瘤細胞的侵襲性增強，這提示了Survivin2β可能作為天然的具有抗凋亡活性拮抗物而存在。Survivin2α可以與Survivin 結(jié)合并且拮抗Survivin的活性，這提示了Survivin2α可能起著調(diào)節(jié)Survivin 活性功能的作用。Zheng等[4]從乳腺癌細胞系B-cap37 中鑒定了最新的人類的Survivin剪接異構(gòu)體Survivin-image(SI)，并認為其可能與腫瘤發(fā)生有密切關系。

Survivin蛋白在已克隆出的8個細胞凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein,IAP)成員中分子量最小，結(jié)構(gòu)也非常獨特。其是由142 個氨基酸組成的蛋白質(zhì)， 相對分子質(zhì)量為16.5 kD。對蛋白的光衍射晶體結(jié)構(gòu)分析表明， Survivin蛋白晶體結(jié)構(gòu)呈廣泛二聚體排列[5]。而與其它IAP 成員結(jié)構(gòu)的主要區(qū)別在于：(1)Survivin 僅含有單個桿狀病毒IAP重復序列(baculovirus IAP repeat,BIR)，而其它IAP 成員均包含2-3 個BIR；(2)Survivin 存在一個由Cys-Pro-Thr 三氨基酸組成的插入片段，將BIR 分成兩個等分模塊，這一插入片段是Survivin所特有的；(3)Survivin C- 末端含有一個由40 個氨基酸組成、長度6.5 nm的疏水α 螺旋卷曲結(jié)構(gòu)， 缺乏IAP 家族成員特有的鋅指結(jié)構(gòu)(zinc finger ring)；(4)BIR序列和α螺旋結(jié)構(gòu)間的連接區(qū)域具有核輸出信號功能， 該信號的突變可引起survivin 抗凋亡與有絲分裂調(diào)控作用的分離[6]。

2 survivin的功能及作用

2.1 survivin與細胞凋亡 細胞凋亡主要有內(nèi)源性因素導致的線粒體通路和外源性因素導致的死亡受體通路。目前認為，Survivin發(fā)揮抗凋亡作用可能是兼具以上兩種通路，而其中可能存在多種途徑。 主要有兩條:(1)Caspase 途徑:抑制凋亡信號轉(zhuǎn)導的上游通路caspase8及caspase9；抑制下游的效應Caspase 3及caspase7的活化；促進IAP 家族其他成員的功能,間接發(fā)揮抗凋亡作用。(2)非Caspase 途徑:通過p21 間接抑制Caspase；通過抑制p53的功能阻斷凋亡過程；通過對紡錘體微管的作用調(diào)節(jié)細胞有絲分裂過程,進而發(fā)揮抗凋亡功能,survivin的這一特性是在所有已知的凋亡調(diào)節(jié)物中獨一無二的。

2.2 survivin與細胞周期 Survivin是一種具有雙重作用的蛋白質(zhì)。除具有抑制細胞凋亡的作用外，還通過干擾CDK和微管網(wǎng)絡影響細胞有絲分裂從而促進細胞存活。其表達有嚴格的細胞周期依賴性，主要在G2/M 期表達[7]，是細胞周期G2/M 期的調(diào)節(jié)基因。Survivin 過表達可減少胞質(zhì)中中心體微管成核和有絲分裂紡錘微管雙向增長[8]從而促進轉(zhuǎn)化細胞異常增殖，并避免腫瘤細胞凋亡的發(fā)生。

有學者用Survivin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染Hela 細胞， 產(chǎn)生大量多倍體細胞和微核的子細胞， 細胞有絲分裂失敗， 細胞凋亡。而在有絲分裂初期， 用抗Survivin 抗體作用于上述細胞， 則染色單體分離異常，過早分離， 不均勻分離，甚至形成腫瘤細胞。因而證實， Survivin 在有絲分裂過程中發(fā)揮非常重要的作用。用微管抑制劑干預Survivin與微管之間的相互作用，可以導致Survivin 抗凋亡活性的喪失以及caspase3 的激活，從而引起細胞凋亡。

2.3 survivin與血管生長 1971年Folkman提出,腫瘤侵襲性生長和轉(zhuǎn)移的形態(tài)學基礎是新生血管的生成，其核心是血管內(nèi)皮細胞的分裂增殖， 2000年Papapetropoulos等報道， Survivin參與了機體組織中血管的生成， 可能是血管形成中生長因子誘導的保護性基因， 維持血管內(nèi)皮細胞的正常增殖。

應用血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)誘導靜止期的內(nèi)皮細胞分裂，血管內(nèi)皮細胞內(nèi)Survivin含量提高了16倍。 Ma等[9]發(fā)現(xiàn)VEGF 可上調(diào)survivin mRNA 的表達， 應用VEGF 受體抑制劑(VEGFTKR)可使survivin 基因的表達明顯下調(diào)。因此,抑制survivin 的表達能通過VEGF 通路的阻斷間接促進腫瘤血管的凋亡性退化，抑制腫瘤生長。

2.4 survivin抗體 Survivin在腫瘤組織中高表達，而在成人終末分化組織中低表達或不表達， 因此腫瘤患者機體免疫系統(tǒng)將視Survivin 蛋白為非己蛋白而產(chǎn)生免疫反應， 并可在其血液中檢測到循環(huán)抗體。人類癌癥能夠誘導機體產(chǎn)生免疫反應，這使血清自身抗體成為癌癥檢測的非常有前景的標志物。用酶聯(lián)免疫吸附試驗和免疫印跡技術在肺癌和結(jié)直腸癌患者血清中檢測到抗survivin 抗體，研究發(fā)現(xiàn)76.4%(42/55)的頭頸腫瘤血清樣本中抗survivin 抗體陽性，而且晚期病例中檢測到了高水平的表達[10]。Eto 等[11]研究顯示，頭頸腫瘤血清中抗survivin 抗體的陽性率為64.7%～77.8%，總陽性率為71.1%(69/97)。

3 Survivin在常見腫瘤組織中的表達及其與凋亡指數(shù)的研究

survivin 廣泛表達于人類腫瘤細胞系，Tamm 等采用了NCI 抗腫瘤藥物篩選程序中的60 種人類腫瘤細胞株，研究了survivin 在體外培養(yǎng)細胞的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn),60 種人類腫瘤細胞株均有survivin 的表達，不同癌組織Survivin 表達陽性率不同，如胃癌為48.12%，結(jié)直腸癌為63.15%，肝癌為70%，乳腺癌為70.17%，胰腺癌為76.19%～88%， 間皮瘤為100% 。

凋亡指數(shù)(AI)是衡量組織中細胞凋亡發(fā)生程度的一項指標。TdT介導的脫氧尿苷酸缺末端標記法(Terminal deoxy-transfer asemediated dUTP nickend lableling,TUNEL)是目前最常用的檢測凋亡細胞方法,屬于原位DNA3′-末端標記法的一種。通過常見腫瘤中的表達及其與凋亡指數(shù)的關系可以看到，survivin 在結(jié)、直腸癌患者總體表達率約為53.2%～63.5% ，其陽性表達與凋亡指數(shù)降低密切相關，在bcl-2 陰性而僅有survivin 表達陽性時即可引起凋亡指數(shù)顯著降低。在乳腺癌患者中， 有70.7% survivin 表達陽性， 其表達與凋亡指數(shù)的降低顯著相關， 而凋亡指數(shù)較低者其生存率顯著低于凋亡指數(shù)較高者， 這一結(jié)果提示，survivin 的表達可以作為預后較差的標志。survivin 在胃癌中有34.5% 呈不同程度表達，其表達獨立于p53 和bcl-2 的陽性表達， 而與凋亡指數(shù)呈顯著負相關。

4 survivin在甲狀腺腫瘤中的表達及其與凋亡指數(shù)的研究

研究表明，甲狀腺癌的發(fā)病率以每年3%的速度遞增[12]。它的發(fā)生約占全身惡性腫瘤的1%，在神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤中占90%以上。證明Survivin對凋亡的抑制可能是其參與甲狀腺癌發(fā)生的重要機制。

Ito等[13]采用RT-PCR法研究了甲狀腺腫瘤中Survivin 的表達，在濾泡狀腺瘤、 濾泡狀癌、乳頭狀癌中Survivin 的表達率為分別為11.1% (2/18)，19.0% (4/21)，22.5%(16/71)，而且Survivin的表達與臨床分期有關，而在未分化型甲狀腺癌中Survivin的表達率高達84.2% (16/19)，強烈提示Survivin的表達與甲狀腺癌的組織學分型有關。

Antonaci等[14]通過免疫組織化學對67例巨大甲狀腺乳頭狀癌患者(其中37例并發(fā)微小癌的患者)的癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶細胞進行survivin蛋白檢測，發(fā)現(xiàn)在同一患者巨大乳頭狀甲狀腺癌組織和微小癌組織中的表達水平?jīng)]有明顯差異。在有侵襲轉(zhuǎn)移的病人中其癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶survivin蛋白的表達水平明顯增高。

項丞等[15]應用免疫印跡法及RT-PCR技術研究98例甲狀腺癌及癌旁組織中Survivin 的表達，結(jié)果顯示兩種方法測得甲狀腺癌組織Survivin表達率均為68.37%，在癌旁組織中survivin均沒有表達。其陽性表達率與病理分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移密切相關(P<0.05)。同時應用TUNEL法測定這些組織的凋亡指數(shù)，結(jié)果survivin表達陽性組AI顯著低于陰性組AI(P<0.01)，提示survivin表達可抑制甲狀腺細胞的凋亡，這可能是其參與甲狀腺癌發(fā)生的重要機制。

錢婀娜等[16]取62例甲狀腺病變標本，包括結(jié)節(jié)性甲狀腺腫 及良惡性甲狀腺腫瘤組織。分別應用 TUNEL法及免疫組化技術對凋亡指數(shù)、細胞增殖核抗原增殖指數(shù)(PCNA-LI,PI) 和Survivin 蛋白的表達進行檢測。測得甲狀腺癌中Survivin 蛋白表達率61.90%，遠高于良性組織中5.00 %的表達率。其陽性表達率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(P<0.05)。 且Survivin 蛋白表達陽性組和陰性組的AI 和PI 均呈負相關，2組間AI 和PI 的差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01) 。

Sugawara等[17]應用免疫組化法研究了6例甲狀腺淋巴瘤和6例橋本甲狀腺炎中Survivin mRNA 與端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hT-ERT mRNA) 的表達，結(jié)果甲狀腺淋巴瘤survivin mRNA 水平高于橋本甲狀腺炎,免疫組化染色證實甲狀腺淋巴瘤的淋巴樣細胞有著豐富的survivin 蛋白的表達。hTERT mRNA 定量不能鑒別二者。因此， 在組織學上難以鑒別時， Survivin mRNA 可作為鑒別甲狀腺淋巴瘤和橋本甲狀腺炎的指標。

Zhou[18]通過RT-PCR和免疫組化這兩種技術測定90例甲狀腺腫瘤中survivin的表達，結(jié)果兩種方法測得survivin在甲狀腺癌中的表達率分別為89.3%和86.7%，均遠遠高于其在甲狀腺良性腫瘤中的表達(P<0.01)。同時發(fā)現(xiàn)survivin在惡性程度越高且存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中具有更高的表達(P<0.05)，而其表達與年齡、性別、組織學亞型和病理階段無統(tǒng)計學意義。他們還通過小干擾RNA(small inter-fering RNA,siRNA) 研究其對survivin的抑制作用，結(jié)果顯示survivin在腫瘤中的表達明顯降低，也說明siRNA可能成為潛在的治療甲狀腺癌的方法。

許珂玉等[19]利用RNAi技術沉默Survivin 基因， 研究其對甲狀腺癌細胞增長的抑制作用，結(jié)果顯示,RNAi 組的細胞凋亡指數(shù)明顯高于其它各組(P<0.01)。細胞增殖主要被阻斷在增殖周期的G0/G1期，而其它各組間沒有顯著性差異。說明了RNAi 作用在增殖早期就起作用，并能夠有效地阻斷survivin 的表達， 促使細胞發(fā)生凋亡， 達到類似基因敲除的效果。因此survivin 基因或可作為甲狀腺癌基因治療的新靶點。

Du等[20]利用免疫印跡及RT-PCR技術研究20例甲狀腺髓樣癌及正常甲狀腺組織中survivin的表達。survivin在甲狀腺髓樣癌中的表達率為80%(8/10),而正常組織中survivin沒有表達(0/10)，且其陽性表達率與其他臨床病理特征無相關性(P>0.05)。同時他利用反義寡核苷酸技術揭示Survivin 反義寡核苷酸能夠顯著下調(diào)survivin mRNA及蛋白的表達，誘導甲狀腺癌細胞凋亡，抑制細胞增殖。

目前對于survivin 的研究正在逐步深入，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復發(fā)、預后、治療及早期診斷中均表現(xiàn)出一定的意義。隨著對survivin的深入研究， 腫瘤發(fā)生發(fā)展機制進一步闡明， 這可能對惡性腫瘤的臨床診斷與治療具有潛在的重大價值。

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050051 石家莊市，河北醫(yī)科大學普通外科2011級研究生(巨濤)；河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院普通外科(劉寧青)

劉寧青，050051 河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院普通外科；

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1002-7386(2014)13-2040-04

2014-02-25)