徐洪杰，戴鐘銓，吳 峰，商 澎，李瑩輝

（1.西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院 空間生物實(shí)驗(yàn)?zāi)M技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安710072；2.中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心 航天醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100094）

空間飛行的微重力環(huán)境會(huì)導(dǎo)致一系列航天醫(yī)學(xué)問(wèn)題的發(fā)生，包括骨丟失、肌肉萎縮、貧血、免疫功能下降和心血管系統(tǒng)紊亂等。研究顯示，為適應(yīng)空間獨(dú)特的微重力環(huán)境，組織體細(xì)胞活性和干細(xì)胞分化能力會(huì)發(fā)生改變［1－4］，進(jìn)而導(dǎo)致相應(yīng)生理系統(tǒng)問(wèn)題的發(fā)生發(fā)展。成體干細(xì)胞是各種組織器官的祖細(xì)胞和支持細(xì)胞，具有自我更新和分化為多種功能細(xì)胞的潛能；參與多種組織器官（如骨骼和造血系統(tǒng)）的失效細(xì)胞的更替及疾病痊愈。隨著干細(xì)胞研究的不斷發(fā)展和深入，微重力效應(yīng)對(duì)成體干細(xì)胞［5］、胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）的影響逐漸成為空間生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。理解微重力對(duì)干細(xì)胞的影響將有助于闡明空間飛行期間的骨丟失、肌肉萎縮和貧血等生理變化的細(xì)胞分子機(jī)理，為采取針對(duì)性的防護(hù)措施提供理論和技術(shù)支持。

干細(xì)胞是具有無(wú)限或長(zhǎng)期的自我更新能力和分化產(chǎn)生至少一種成熟特異體細(xì)胞能力的細(xì)胞［6］。成體干細(xì)胞研究最早，但分化潛能有限。ESCs由于其巨大的分化潛能一度成為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)，但是倫理爭(zhēng)議和免疫排斥的問(wèn)題限制了其臨床應(yīng)用。2007年體細(xì)胞重編程獲得的類似ESCs潛能的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）彌補(bǔ)了上述缺陷，該研究獲得2012年諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。研究表明成體干細(xì)胞的多能性、增殖［5］和分化潛能［3，7－9］受重力的影響。目前，失重條件下ESCs的研究才剛剛開(kāi)始［10］，而微重力對(duì)iPSCs的作用尚無(wú)報(bào)道。作者在此綜述了iPSCs的發(fā)現(xiàn)及最新研究進(jìn)展，重點(diǎn)闡述重編程方法的優(yōu)化及其在航天醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用展望，擬為開(kāi)展微重力對(duì)iPSCs影響的研究提供參考。

1 多能干細(xì)胞研究簡(jiǎn)述

多能干細(xì)胞包括ESCs、胚胎生殖細(xì)胞（embryonic germ cells，EG）、胚胎腫瘤細(xì)胞（embryonic carcinoma cells，EC）和iPSCs。有文獻(xiàn)［11］將生殖干細(xì)胞（multipotent germline stem cells，mGSC）和骨髓的前體細(xì)胞（multipotent adult progenitor cell）也并入此列。在畸胎瘤中發(fā)現(xiàn)的EC［12］是最早研究的多能干細(xì)胞。由于致瘤性、分化潛能有限且不能形成嵌合小鼠，其研究?jī)r(jià)值逐漸被1981年分離培養(yǎng)成功的小鼠ESCs［13］所取代。1998年John等通過(guò)分離原始生殖細(xì)胞培養(yǎng)后獲得了人EG［14］，同年從動(dòng)物囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離培養(yǎng)獲得了ESCs［15－16］。這3種多能干細(xì)胞中ESCs最有研究和應(yīng)用價(jià)值。

成熟的細(xì)胞由分化狀態(tài)被逆轉(zhuǎn)到未分化狀態(tài)的過(guò)程稱為細(xì)胞重編程［17］。通過(guò)重編程可由體細(xì)胞獲得多能干細(xì)胞。目前可實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞重編程的方法包括：細(xì)胞核移植［18］、體細(xì)胞與多能細(xì)胞融合［19－20］、用ESCs提取物處理體細(xì)胞［21］以及某些類型細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)自發(fā)產(chǎn)生［22－24］。然而這些方法的應(yīng)用條件復(fù)雜、重編程效率低。同時(shí)，核移植或細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)提示篩選出有效的多能性相關(guān)的特定因子可能有助于建立簡(jiǎn)便高效的重編程方法。

2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的建立

受細(xì)胞重編程方法的啟示，2006年Takahashi等［25］選擇24種在小鼠早期胚胎、ESCs或腫瘤細(xì)胞中豐富表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)組合、篩選，發(fā)現(xiàn)用Oct4、Sox2、c－Myc和Klf4四個(gè)因子可有效地將胎鼠成纖維細(xì)胞和小鼠尾尖成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成形態(tài)和生長(zhǎng)特性類似ESCs的克隆，即iPSCs。Thomason等使用慢病毒介導(dǎo)Oct4、Sox2、Nanog和Lin28四個(gè)因子獲得了人的iPSCs［26］，但得到的iPSCs不能形成成年的嵌合體小鼠，且沒(méi)有生殖系轉(zhuǎn)移（germline transmission）的能力，而這是鑒定多能干細(xì)胞的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)之一。隨后發(fā)現(xiàn)其原因是使用了Fbx15啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的新霉素抗性基因來(lái)篩選iPSCs，F(xiàn)bx15在ESCs中表達(dá)量較高，但在自我更新和多潛能性的維持中不是必需的［27］。改進(jìn)的篩選系統(tǒng)［28－29］以O(shè)ct4和Nanog取代Fbx15，得到既高效嵌合成年小鼠、又參與形成生殖系細(xì)胞的iPSCs，并獲得了iPSCs衍生的后代小鼠。

猴和豬體形與人相仿，器官大小、結(jié)構(gòu)和功能最適合人體移植，因此在小鼠iPSCs的基礎(chǔ)上陸續(xù)又建立了猴［30］、大鼠［31－32］和豬［33］的iPSCs。此外，大鼠ESCs很難獲得，大鼠iPSCs在ESCs未建系的情況下建立，為大鼠的轉(zhuǎn)基因模式動(dòng)物的建立奠定了基礎(chǔ)。

3 重編程方法的優(yōu)化

根據(jù)基因?qū)敕绞降牟煌鼐幊谭椒煞譃椴《据d體和非病毒載體兩類。病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體，其優(yōu)點(diǎn)是誘導(dǎo)效率高（如新生兒包皮成纖維細(xì)胞重編程效率高達(dá)0.01%［26］），缺點(diǎn)是外源因子永久整合基因組，有插入突變風(fēng)險(xiǎn)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體一般只能轉(zhuǎn)染分裂旺盛的細(xì)胞，腺病毒載體可實(shí)現(xiàn)外源基因的瞬時(shí)表達(dá)，但仍有外源基因的整合。非病毒載體的方法包括使用脂質(zhì)體或piggyBac轉(zhuǎn)座子載體、mRNA或microRNA轉(zhuǎn)染、蛋白質(zhì)直接介導(dǎo)、小分子化合物聯(lián)用等。重編程效率低和外源基因整合的風(fēng)險(xiǎn)是上述方法面臨的共同難題。

3.1 提高安全性

病毒載體介導(dǎo)的誘導(dǎo)方式由于插入突變而具有誘發(fā)腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。非病毒載體的誘導(dǎo)方式包括2A肽非病毒轉(zhuǎn)染法［34］、誘導(dǎo)性表達(dá)載體法［35］、Cre／LoxP重組切除法［36］及PB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)法［37］等。其中Cre不能介導(dǎo)載體完全切除，而PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可將外源DNA徹底清除，是一種更安全的方法。但是目前完全避免使用病毒或轉(zhuǎn)座子的方法如非整合腺病毒［38］、脂質(zhì)體［39］和非插入型的附加體（episomal）［40］等轉(zhuǎn)染效率極低，還需要尋找更有效的誘導(dǎo)方法。

某些細(xì)胞已表達(dá)特定因子，因此只需導(dǎo)入其它幾個(gè)即可完成重編程過(guò)程。研究表明Oct4和Klf4雙因子［41－42］或Oct4單因子［43］均可建立iPSCs。有研究證明小分子化合物可替代轉(zhuǎn)錄因子，如組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a的抑制劑BIX－01294可替代Oct4［44］，隨后發(fā)現(xiàn)BIX－01294和BayK8644協(xié)同Oct4和Klf4［45］、組蛋白去乙酰化酶抑制劑丙戊酸（valproic acid，VPA）協(xié)同Oct4和Sox2可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞重編程［46］。

更安全的重編程方式是不涉及任何基因修飾，目前僅有蛋白介導(dǎo)的方式。2009年Zhou等［47］利用細(xì)胞穿膜肽11R引導(dǎo)四因子的重組蛋白并聯(lián)合使用VPA成功重編程鼠成纖維細(xì)胞，但重編程效率僅0.001%。

3.2 提高重編程的效率

轉(zhuǎn)染效率低及重編程本身的隨機(jī)性是誘導(dǎo)效率提高的瓶頸。重編程效率與外源因子的誘導(dǎo)水平、內(nèi)源相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平、其它因子過(guò)表達(dá)或RNAi表達(dá)能力等生物因素有關(guān)，也與化學(xué)物質(zhì)使用、物理刺激和細(xì)胞培養(yǎng)條件等非生物因素有關(guān)。最初iPSCs建系效率只有0.02%［25］，而減少轉(zhuǎn)錄因子以降低腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的策略導(dǎo)致重編程效率更低、時(shí)程更長(zhǎng)，即使所有四因子同時(shí)使用時(shí)最多也只能達(dá)到2%［35，48］，短時(shí)間內(nèi)不能得到足量的細(xì)胞嚴(yán)重阻礙著iPSCs的臨床應(yīng)用。目前提高重編程效率的途徑主要包括篩選小分子化合物、細(xì)胞類型和探索新的誘導(dǎo)因子幾個(gè)方面。小分子化合物除了BIX－01294［44］和VPA［46］，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5－aza－cytidine（AZA）［49］、丁酸鹽（butyrate）［50］、組蛋白脫乙?；敢种苿┒∷徕c和TGF－β信號(hào)抑制劑SB431542［51］和糖原合成酶（glycogensynthase kinase－3，GSK－3）抑制劑CHIR990213［52］都能提高重編程效率，其中VPA可提高100多倍。

細(xì)胞類型也是影響重編程效率的重要因素。除了小鼠成纖維細(xì)胞，胃和肝細(xì)胞［34］、神經(jīng)干細(xì)胞［41］、胰腺β細(xì)胞［53］、終末分化的B淋巴細(xì)胞［35］等重編程效率各不相同［41－43］。胃和肝細(xì)胞產(chǎn)生的iPSCs的成瘤性明顯低于皮膚成纖維細(xì)胞［34］。人源iPSCs的報(bào)道較少，除成纖維細(xì)胞外，已有報(bào)道的源細(xì)胞包括人的血液CD34細(xì)胞［54］和皮膚角質(zhì)細(xì)胞［55］。逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)四因子重編程青少年角化細(xì)胞的效率比成纖維細(xì)胞高100多倍，而且時(shí)程縮短近一半［55］。

蛋白介導(dǎo)重編程的效率低是因?yàn)榈鞍讓?dǎo)入細(xì)胞的效率低，因此尋找導(dǎo)入效率更高的誘導(dǎo)因子如RNA有望解決此問(wèn)題。Warren等［56］使用四因子的mRNA誘導(dǎo)時(shí)程縮短一半，效率提高了100多倍。miR－302和miR－367也有相似的效果［57］，原因可能是通過(guò)激活Oct4并抑制組蛋白脫乙酰基酶HDAC2而促進(jìn)iPSCs的形成。另外利用siRNA干擾抑癌基因p53能顯著提高重編程效率，同時(shí)下調(diào)p53和過(guò)量表達(dá)UTF1甚至可替代c－Myc并提高效率100倍［58］，p53缺失時(shí)僅需Oct4、Sox2雙因子［59］。但是缺失關(guān)鍵抑癌基因的方法將增加基因組的不穩(wěn)定性或誘導(dǎo)腫瘤的產(chǎn)生，可能帶來(lái)得不償失的風(fēng)險(xiǎn)，這提示研究者提高重編程的效率要與iPSCs的安全性兼顧。

物理微環(huán)境和機(jī)械張力影響間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）分化的證據(jù)越來(lái)越多，因此除了生物因素，細(xì)胞培養(yǎng)條件等物理因素對(duì)細(xì)胞重編程過(guò)程的調(diào)控也有必要進(jìn)行研究。航天特殊環(huán)境如微重力、低氧可能影響重編程的效率。已有研究表明低氧條件可以提高重編程效率，促進(jìn)ESCs向視網(wǎng)膜前體細(xì)胞分化［60－61］，但是ESCs或iPSCs對(duì)機(jī)械刺激的響應(yīng)幾乎未見(jiàn)報(bào)道。

4 應(yīng)用

隨著基礎(chǔ)研究的不斷深入，iPSCs在疾病模型構(gòu)建、藥物篩選、細(xì)胞治療中的應(yīng)用效果顯著。利用iPSCs獲得人體特異細(xì)胞或組織是應(yīng)用的最終目標(biāo)。

4.1 疾病模型構(gòu)建

Jaenisch博士首次用小鼠iPSCs建立人疾病模型［62］，并用于治療人性化的鐮刀型貧血癥小鼠模型和帕金森病大鼠模型，從理論和實(shí)踐上為人類單基因遺傳疾病治療奠定基礎(chǔ)，也證明了iPSCs治療復(fù)雜疾病的可能性。2009年Ebert等［63］利用患者成纖維細(xì)胞重編程的iPSCs成功再現(xiàn)脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）進(jìn)行性變性的過(guò)程。82歲高齡的女性肌萎縮性側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）病人的成纖維細(xì)胞重編程的iPSCs可獲得疾病特異性的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元［64］，證明慢性病老年患者也可以直接從iPSCs獲得疾病特異性模型。用人iPSCs還建立了女性流行性神經(jīng)發(fā)育疾病Rett綜合癥（Rett syndrome，RTT）［65］、致命性亨廷頓病（Huntington′s disease HD）［66］、X－連鎖隱性遺傳病進(jìn)行性假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良（duchenne muscular dystrophy，DMD）［67］、21三體導(dǎo)致的特瓦綜合癥（down syndrome，DS）［68］、豹皮綜合癥［69］、人I型糖尿?。?0］、骨髓增生?。╩yeloproliferative disorders，MPDs）［71］、范可尼貧血癥［71］、肝?。?2］、家族性植物神經(jīng)功能障礙癥（falilial dysautonomia，F(xiàn)D）［73］等疾病模型，為發(fā)病機(jī)制和新穎高效治療方法的研究提供了有利條件。

建立人iPSCs疾病模型首先要選擇取材安全、方便的體細(xì)胞，不同體細(xì)胞來(lái)源的iPSCs保留供體細(xì)胞的基因印跡，而且轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳和分化能力均有所差異，因此有必要評(píng)價(jià)不同體細(xì)胞來(lái)源的iPSCs差異性對(duì)疾病模型的安全性、有效性的影響。

4.2 藥物篩選

目前已使用疾病特異性的iPSCs模型對(duì)FD候選藥物激動(dòng)素Kinetin［73］、針對(duì)SMA患者提高SMN蛋白水平的藥物VPA和tobramycin、抗血管生成藥物Azumanaid ESCs進(jìn)行了評(píng)價(jià)，可對(duì)iPSCs分化的功能細(xì)胞進(jìn)行藥物效果的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，為個(gè)性化藥物篩選和藥效研究提供了廣闊的平臺(tái)。

4.3 細(xì)胞治療

除了建立疾病模型外，患者個(gè)體化的iPSCs進(jìn)行遺傳修飾之后定向分化健康細(xì)胞來(lái)進(jìn)行細(xì)胞移植，理論上可以治療任何遺傳性疾病和退行性疾病。目前通過(guò)人iPSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?3－64］、I型糖尿?。?4］、肝病、腎病等的效果都已經(jīng)在動(dòng)物模型中得到驗(yàn)證，人ESCs已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)。

5 在航天醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

航天飛行導(dǎo)致一系列生理性改變的主要原因是微重力條件，因此研究微重力效應(yīng)對(duì)細(xì)胞功能的影響，特別是對(duì)維持組織細(xì)胞更新的干細(xì)胞的活性和功能的影響，找到關(guān)鍵性靶點(diǎn)是從根本上解決航天醫(yī)學(xué)問(wèn)題的關(guān)鍵，對(duì)胚胎發(fā)育生理學(xué)也有重要意義。

研究表明，模擬微重力能抑制成體干細(xì)胞向力敏感性細(xì)胞（如成骨細(xì)胞和心肌細(xì)胞）的分化，而促進(jìn)其向力不敏感細(xì)胞（如脂肪細(xì)胞［7－8］）的分化。相對(duì)于正常的1G條件，3－D回轉(zhuǎn)器模擬微重力條件有利于維持hMSC細(xì)胞增殖和透明軟骨向分化潛能［75］、促進(jìn)肝干細(xì)胞的分化能力［3］和MSC向髓核樣細(xì)胞的分化潛能［76］，但是大梯度強(qiáng)磁場(chǎng)模擬微重力效應(yīng)抑制hMSC早期的成骨向分化［7］，回轉(zhuǎn)模擬微重力效應(yīng)也抑制hMSC成骨向分化、促進(jìn)脂肪向分化［77］。

模擬微重力條件下mESCs細(xì)胞總數(shù)減少、細(xì)胞增殖活性沒(méi)有變化、粘附減弱、DNA無(wú)損傷，但是影響輻射誘導(dǎo)損傷的修復(fù)［10］，是否對(duì)多潛能的維持和譜系分化能力產(chǎn)生影響亟待研究。局部機(jī)械力影響mESCs伸展方向，但分化后的細(xì)胞硬度增大，單個(gè)ESCs細(xì)胞中Oct4表達(dá)水平改變［78］。然而此方法或模擬微重力可否激活內(nèi)源性重編程因子、促進(jìn)重編程而成為不使用化學(xué)因子的更安全的重編程方法仍不明確。模擬微重力對(duì)干細(xì)胞干性及分化潛能的影響的研究為解決微重力性骨丟失等諸多問(wèn)題奠定了理論基礎(chǔ)，但是力學(xué)傳導(dǎo)的機(jī)制目前并不清楚。iPSCs方法的建立必將為研究胚胎發(fā)育復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制及遺傳疾病機(jī)制提供優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞和組織模型，為解決航天醫(yī)學(xué)的基本問(wèn)題提供新的思路。

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