李 琳，趙朝成，劉其友，張?jiān)撇?，?雷

(中國(guó)石油大學(xué)(華東)化學(xué)工程學(xué)院，山東 青島 266580)

含硫雜環(huán)芳烴(polycyclic aromatic sulfur heterocycles，PASHs)是原油中硫的主要存在形態(tài)，主要是噻吩類化合物，也包括少量帶有芳基的硫醇、硫醚和二硫化物[1]，屬于污染面廣、毒性較大的難降解有機(jī)物，廣泛存在于石油污染土壤、海底沉積物、被污染的地下水及許多工業(yè)(如焦化、石油化工、農(nóng)藥、染料等)廢水中。環(huán)境介質(zhì)中的PASHs比多環(huán)芳烴(PAH)具有更強(qiáng)的致癌性和生物富集性，是最不易被降解的化合物之一[2-3]。

在石油的開采加工過程中，遺漏、井噴、輸油管道泄漏等問題會(huì)導(dǎo)致油田區(qū)土壤受到PASHs的污染，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。相比物理和化學(xué)處理方法，微生物法處理PASHs污染土壤具有經(jīng)濟(jì)高效、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[4]。

我國(guó)許多油田都位于干旱和半干旱地區(qū)，如勝利油田、華北油田和新疆油田等。由于油田區(qū)特殊的氣候和水環(huán)境條件，容易造成油田區(qū)土壤的鹽分積累[5]。目前很多具有PASHs降解能力的細(xì)菌和真菌相繼被篩選出來(lái)，但是由于油田區(qū)土壤的高鹽度使得這些微生物的降解能力受到抑制。因此，篩選具有耐鹽性的PASHs降解菌可能是有效的解決途徑。中度嗜鹽菌是一類依賴0.5～2.5 mol·L-1鹽濃度生長(zhǎng)的微生物類群，營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境有很好的適應(yīng)能力，在環(huán)境污染治理方面日益受到重視[6]。

作者以二苯并噻吩作為PASHs的模式化合物，從勝利油田石油污染的高鹽土壤中篩選分離出6株具有PASHs降解能力的中度嗜鹽菌，并考察了底物初始濃度、pH值、溫度及氮磷比對(duì)降解效果的影響，通過正交實(shí)驗(yàn)得到其最佳培養(yǎng)條件，以期為深入研究中度嗜鹽菌對(duì)PASHs的降解奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 土樣采集及預(yù)處理

以勝利油田石油污染土壤作為土樣。取4種不同深度(0～5 cm、5～10 cm、10～15 cm、15～20 cm)的土樣混合均勻，裝入采集袋中。土樣過2 mm篩，去除2 mm以上的沙礫和植物殘?bào)w，采用四分法收集土樣，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(g·L-1)：Na2HPO40.6，KH2PO40.2，NaNO34.0，MgSO40.3，CaCl20.01，F(xiàn)eSO40.01，NaCl 50，酵母膏 0.5，pH值7.5。

LB培養(yǎng)基(g·L-1)：蛋白胨10.0，酵母浸出汁5.0，NaCl 50.0，瓊脂20.0(固體培養(yǎng)基用)。

篩選固體培養(yǎng)基：在固體培養(yǎng)基上涂一定濃度的二苯并噻吩。

富集培養(yǎng)基：在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入一定濃度的二苯并噻吩。

1.3 方法

1.3.1 中度嗜鹽菌的篩選、分離與保藏

取5 g土樣加入到含二苯并噻吩50 mg·L-1、鹽度為5%的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(100 mL)中，于30 ℃、160 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)7 d。再按15%的接種量轉(zhuǎn)接至新的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，如此重復(fù)5次進(jìn)行馴化培養(yǎng)。最后將菌群富集培養(yǎng)液依次稀釋成濃度梯度為10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的菌懸液，然后取0.1 mL菌懸液涂布在篩選固體培養(yǎng)基上，倒置，于30 ℃培養(yǎng)12～16 h。挑選菌落周圍出現(xiàn)清晰降解圈的菌株，轉(zhuǎn)接斜面，于4 ℃冰箱保藏。觀察菌株形態(tài)，并進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 降解率的測(cè)定

將培養(yǎng)后的培養(yǎng)基用鹽酸酸化至pH≤2，用乙酸乙酯等體積萃取，于3 000 r·min-1離心10 min后取上清液用氣相色譜儀(Bruker 450 GC-FID)測(cè)定二苯并噻吩含量，按下式計(jì)算降解率(η)：

式中：c0、ck分別為降解前后二苯并噻吩的濃度;η0為空白降解率。

色譜條件：以恒流方式進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL；升溫程序：柱溫50 ℃保持4 min，然后以3 ℃·min-1升溫至130 ℃，再以15 ℃·min-1升溫至300 ℃，最后在300 ℃下保持15 min；進(jìn)樣器和檢測(cè)器的溫度均為300 ℃，載氣為氦氣，流速1 mL·min-1。

1.3.3 最佳培養(yǎng)條件的研究

針對(duì)篩選得到的降解效果最好的中度嗜鹽菌，通過單因素實(shí)驗(yàn)考察底物初始濃度、pH值、溫度、氮磷比等因素對(duì)其降解效果的影響，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)pH值、溫度及氮磷比的3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，確定其最佳培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 降解二苯并噻吩中度嗜鹽菌的篩選及生理生化特征

將經(jīng)過5次富集馴化后的混合培養(yǎng)物在篩選固體培養(yǎng)基上稀釋涂布，挑選有明顯降解圈、不同顏色和形態(tài)的單菌落，經(jīng)過復(fù)篩、純化后得到6株能夠以二苯并噻吩為唯一碳源和能源生長(zhǎng)的中度嗜鹽菌，其中菌株SL-4對(duì)二苯并噻吩的降解率最高(37.2%)，如圖1所示。

圖1 篩選菌株的降解率Fig.1 The degradation rate of the strains screened

對(duì)篩選得到的6株具有降解能力的中度嗜鹽菌進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

表1篩選菌株的形態(tài)特征及生理生化特征

Tab.1 The morphological,physiological and biochemical characteristics of the strains screened

注：“+”表示陽(yáng)性，“-”表示陰性。

2.2 底物初始濃度對(duì)SL-4菌株降解效果的影響(圖2)

圖2 底物初始濃度對(duì)SL-4菌株降解二苯并噻吩的影響Fig.2 The effect of initial substrate concentration on degradation of dibenzothiophene by strain SL-4

由圖2可知,SL-4菌株在以二苯并噻吩為唯一碳源的含鹽(NaCl 5%)培養(yǎng)基中可以降解不同濃度的二苯并噻吩，其降解率隨底物初始濃度的增大先升高后降低，當(dāng)?shù)孜锍跏紳舛葹?00 mg·L-1時(shí)，降解效果最好，降解率達(dá)到56.4%。原因可能是低濃度的底物滿足不了微生物的生長(zhǎng)需要，不利于維持降解所必需的微生物量，而高濃度的底物又對(duì)微生物有一定的毒害作用，不利于微生物的生長(zhǎng)代謝，同時(shí)降解產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也會(huì)抑制底物的降解[7]。

2.3 pH值對(duì)SL-4菌株降解效果的影響

培養(yǎng)基鹽度為5%，pH值對(duì)SL-4菌株降解二苯并噻吩效果的影響如圖3所示。

圖3 pH值對(duì)SL-4菌株降解二苯并噻吩的影響Fig.3 The effect of pH value on degradation of dibenzothiophene by strain SL-4

由圖3可知，SL-4菌株在pH值為5.5～9.5范圍內(nèi)均能降解二苯并噻吩，但pH值對(duì)降解效果影響較大，SL-4菌株的最適pH值為7.5。原因可能是pH值會(huì)改變微生物細(xì)胞的表面電荷，從而影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[8-9]。相對(duì)于酸性環(huán)境，偏堿性(7.5～8.5)的環(huán)境更適于SL-4菌株的生長(zhǎng)。

2.4 溫度對(duì)SL-4菌株降解效果的影響

微生物的生長(zhǎng)代謝是在酶的催化作用下進(jìn)行的，適宜的溫度是保證酶活性的重要條件之一[10]。溫度對(duì)SL-4菌株降解二苯并噻吩效果的影響如圖4所示。

圖4 溫度對(duì)SL-4菌株降解二苯并噻吩的影響Fig.4 The effect of temperature on degradation ofdibenzothiophene by strain SL-4

由圖4可知，SL-4菌株在25～45 ℃范圍內(nèi)均能降解二苯并噻吩。隨著溫度的升高，SL-4菌株對(duì)二苯并噻吩的降解率先升高后降低，在溫度為30 ℃時(shí)，降解率最高。原因可能是溫度過高時(shí)SL-4菌株的活性降低，降解效果變差。

2.5 氮磷比對(duì)SL-4菌株降解效果的影響

微生物的生長(zhǎng)受到氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度的影響，而氮、磷的影響往往是相互的，所以在實(shí)際生物修復(fù)污染物的過程中，應(yīng)當(dāng)投加適宜比例的氮磷物質(zhì)來(lái)提高降解微生物的修復(fù)效果。氮磷比對(duì)SL-4菌株降解二苯并噻吩效果的影響如圖5所示。

圖5 氮磷比對(duì)SL-4菌株降解二苯并噻吩的影響Fig.5 The effect of N∶P on degradation ofdibenzothiophene by strain SL-4

由圖5可知，當(dāng)?shù)妆葹?∶1時(shí)，SL-4菌株對(duì)二苯并噻吩的降解效果最好，降解率達(dá)到63.2%。

2.6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以pH值、溫度及氮磷比為考察因素，以二苯并噻吩的降解率為考核指標(biāo)進(jìn)行3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析如表2所示。

表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

Tab.2Theresultsandanalysisoforthogonalexperiment

實(shí)驗(yàn)號(hào)pH值溫度/℃氮磷比降解率/%16.5254∶153.226.5306∶159.436.5358∶150.147.5256∶167.157.5308∶163.367.5354∶151.278.5258∶154.688.5304∶150.298.5356∶153.1k154.23358.30056.533k260.53357.63359.867k352.63351.46756.000R7.9006.8338.334

由表2可知，各因素對(duì)SL-4菌株降解效果的影響大小依次為：氮磷比>pH值>溫度；該中度嗜鹽菌株的最佳培養(yǎng)條件為：pH值7.5，溫度25 ℃，氮磷比6∶1。

3 結(jié)論

從勝利油田石油污染土壤中篩選得到6株對(duì)二苯并噻吩具有降解能力的中度嗜鹽菌，其中SL-4菌株降解效果最好，在底物濃度為50 mg·L-1、培養(yǎng)基鹽度為5%條件下對(duì)二苯并噻吩的降解率達(dá)到37.2%。通過單因素實(shí)驗(yàn)考察了底物初始濃度、pH值、溫度及氮磷比對(duì)SL-4菌株降解效果的影響，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明氮磷比對(duì)SL-4菌株降解效果的影響最為顯著，最佳培養(yǎng)條件為：pH值7.5、溫度25 ℃、氮磷比6∶1。

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