段須杰，任 彤

（江蘇先聲藥業(yè)有限公司，江蘇 南京210042）

由于抗體藥物具有靶向明確、副作用小等優(yōu)勢，近年來受到國內(nèi)外藥企的廣泛關(guān)注。2012年，全球抗體藥物銷售額已達(dá)650億美元［1－2］。我國通過“新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)為生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供強(qiáng)有力的科技支撐，同時越來越多的抗體藥物面臨“專利懸崖”，因此形成了抗體藥物的開發(fā)熱潮［3］。然而，動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝開發(fā)已成為國內(nèi)抗體藥物研發(fā)過程中的主要限制因素［4－5］。其中，動物細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)化更是為國外生物技術(shù)公司所壟斷，嚴(yán)重制約著國內(nèi)抗體藥物產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。氨基酸作為培養(yǎng)基中的重要營養(yǎng)物質(zhì)，直接對細(xì)胞生長、抗體表達(dá)以及抗體質(zhì)量有著重大影響［6］。因此，實(shí)時監(jiān)測培養(yǎng)過程中的氨基酸濃度將為自主開發(fā)培養(yǎng)基產(chǎn)生重要的指導(dǎo)作用。但到目前為止，關(guān)于動物細(xì)胞培養(yǎng)上清中氨基酸濃度的測定卻鮮有報(bào)道［7］。

按照是否衍生可將氨基酸分析方法分為直接分析法和衍生化間接分析法。然而基于離子交換色譜的氨基酸分析儀由于專屬性強(qiáng)、價格昂貴，大大限制了其推廣和應(yīng)用。柱前衍生化憑借著方法靈活、靈敏度高、分析時間短等優(yōu)點(diǎn)，近年來得到迅速發(fā)展，并已在眾多領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用［8］。6－氨基喹啉基－N－羥基琥珀酰－亞氨基甲酸酯（6－aminoquinolyl－N－h(huán)ydroxysuccinimidyl carbamate，簡稱AQC），作為一種較新的柱前衍生化試劑，具有靈敏度高、定量準(zhǔn)確、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，非常適合于復(fù)雜樣品中的氨基酸分析［9－11］。作者在此首次報(bào)道了采用AQC柱前衍生化HPLC法測定CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清中21種氨基酸濃度，旨為動物細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)化提供理論指導(dǎo)［12－15］。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 樣品、試劑與儀器

所用樣品均來自實(shí)際CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清。

美國Waters公司AccQ.Tag氨基酸測定試劑盒：包括AccQ－FlourTM氨基酸專利衍生劑，專用氨基酸分析柱，玻璃樣品衍生管，17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（氨基酸濃度均為2.5mmol·L－1）。羥脯氨酸、色氨酸、天冬酰胺，德國Applichem公司；谷氨酰胺，美國Life Technologies公司；乙腈為色譜純。

Agilent 1260型高效液相色譜儀：包括1260Duat Pump VL四元泵、1260FLD熒光檢測器、1260DAD檢測器；便攜式pH計(jì)，梅特勒－托利多公司。

1.2 方法

1.2.1 流動相的制備

流動相A：美國Life Technologies公司提供。配制儲備液為10×，使用時用Milli－Q水將其稀釋；流動相B：乙腈－水（60∶40，體積比）。

1.2.2 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

添加谷氨酰胺、天冬酰胺、色氨酸、羥脯氨酸等4種氨基酸至17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中，并控制21種氨基酸終濃度為0.2mmol·L－1。

1.2.3 CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清的處理

CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清成分復(fù)雜，包含多種成分（如多肽和蛋白質(zhì)等）。為防止這些成分對氨基酸測定產(chǎn)生影響以及造成柱堵塞，需將多肽和蛋白質(zhì)等物質(zhì)去除［8］，由于流動相中含有乙腈，因此利用乙腈將其沉淀。

為將CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清中蛋白質(zhì)全部沉淀，對乙腈與CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清的體積比（1∶1、2∶1、3∶1和4∶1）進(jìn)行了對比研究。過程如下：將CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清用一定量的乙腈沉淀后，取上清，再加入等體積的乙腈，如果此時沒有沉淀生成表明蛋白質(zhì)已經(jīng)去除完全。

1.2.4 衍生化試劑的制備和CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清衍生化處理

移取衍生劑1mL至衍生化粉末中，55℃加熱10min使粉末充分溶解，即得衍生化試劑。該衍生化試劑在室溫干燥箱內(nèi)至少可儲存一周。

衍生化溶液由10μL CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清、70μL硼酸緩沖溶液和20μL衍生化試劑組成。

1.2.5 色譜條件的確定

就不同pH值流動相A對色譜峰分離效果的影響進(jìn)行考察。由于配制的10×流動相A儲備液pH值為5.72，因此考察的pH值范圍為5.8～6.0。

通過多次摸索和調(diào)整，確定適宜的梯度洗脫程序。

2 結(jié)果與討論

2.1 CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清處理結(jié)果

分別用1∶1、2∶1、3∶1、4∶1（乙腈與CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清的體積比）的乙腈沉淀CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈與CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清的體積比為2∶1時，蛋白質(zhì)即可以去除完全，因此，用2BV乙腈與CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清混合靜置1h后，于10 000r·min－1離心10min，取上清用于氨基酸濃度測定。

2.2 色譜條件的確定

色譜柱：Waters AccQ.Tag氨基酸分析色譜柱C18（3.9mm×150mm，4μm）；流速1mL·min－1；熒光激發(fā)波長250nm，發(fā)射波長395nm；由于色氨酸對熒光猝滅，因此采用250nm紫外檢測器對其進(jìn)行檢測；柱溫為42.5℃；進(jìn)樣量為5μL。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，有4對峰對pH值變化較敏感，分別為ASN／AMQ、HIS／NH4、ARG／ALA和CYS／VAL。當(dāng)pH值低于5.85時，ASN／AMQ峰重合無法分開，其余3對峰隨pH值變化分離度呈現(xiàn)不同變化規(guī)律：CYS／VAL隨pH值升高分離度降低，HIS／NH4隨pH值升高分離度略有上升，ARG／ALA隨pH值升高分離度降低。綜合考慮所有峰的分離水平，確定流動相A的pH值為5.93。

經(jīng)多次摸索和調(diào)整，確定梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

2.3 HPLC圖譜

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的HPLC圖譜見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

將氨基酸終濃度為0.2mmol·L－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋至0.15mmol·L－1、0.10mmol·L－1、0.08 mmol·L－1、0.06mmol·L－1、0.04mmol·L－1和0.02mmol·L－1。精密量取上述不同濃度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液5μL，按1.2.4進(jìn)行衍生化處理。按色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以摩爾數(shù)（y）對峰面積（x）作圖并進(jìn)行線性回歸，得到21種氨基酸的回歸方程及線性范圍，列于表2。

由表2可看出，21種氨基酸在濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。

圖1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（a）及樣品（b）的HPLC圖譜Fig.1 HPLC Chromatograms of amino acid standard（a）and sample（b）

表2 回歸方程及線性范圍Tab.2 Regression equations and linear ranges

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

將實(shí)際CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清適當(dāng)稀釋以保證氨基酸濃度在檢測范圍內(nèi)。按1.2.3進(jìn)行樣品處理，按1.2.4進(jìn)行衍生化處理。連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算氨基酸出峰面積，結(jié)果見表3。

由表3可看出，各氨基酸的峰面積RSD均小于5%，說明該方法的精密度良好。

2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

將實(shí)際CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清適當(dāng)稀釋以保證氨基酸濃度在檢測范圍內(nèi)。按1.2.3進(jìn)行樣品處理，取50μL處理后的上清，分別加入0.10mmol·L－1氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液40μL、60μL和70μL。每個樣品連續(xù)進(jìn)樣3針，計(jì)算回收率（表4）。平均回收率（n＝9）為96.8%，RSD＝4.93%。表明該方法可行、準(zhǔn)確，符合氨基酸濃度測定要求。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of precision experiment（n＝6）

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab.4 Results of recovery experiment（n＝3）

2.7 樣品穩(wěn)定性考察

取衍生化后的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清，在4℃進(jìn)樣盤中分別于0h、10h、36h和60h進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，并計(jì)算各氨基酸濃度。結(jié)果表明：與0h測定的19種氨基酸濃度相比，10h測定的偏差在5%以內(nèi)，36h測定的偏差在20%以內(nèi)，60h測定的偏差在30%以內(nèi)。這與衍生化溶劑乙腈隨放置時間延長而揮發(fā)有關(guān)，導(dǎo)致測定濃度增大。為了保證測定的準(zhǔn)確性，衍生化樣品放置時間應(yīng)控制在36h以內(nèi)。

3 結(jié)論

首次報(bào)道了AQC柱前衍生化HPLC方法測定CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清中21種氨基酸含量，并對該分析方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明，該方法線性范圍較寬，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，能夠在50min內(nèi)完成21種氨基酸濃度的測定。該方法經(jīng)濟(jì)，具有較高的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度，可以滿足動物細(xì)胞培養(yǎng)上清中氨基酸分析的要求，對后續(xù)培養(yǎng)基優(yōu)化具有重要的指導(dǎo)意義。

（致謝：感謝美國Life Technologies公司在氨基酸方法建立過程中提供的技術(shù)支持?。?/p>

［1］Therapeutic monoclonal antibodies approved or in review in the European Union or United States［EB／OL］.［2013－04－05］.http：／／antibodysociety.org／news／approvedmabs.php.

［2］TOP 20best－selling drugs approved and launched during 2012［EB／OL］.［2013－04－08］.http：／／www.genengnews.com／insight－and－intelligenceand153／top－20－best－selling－drugs－approvedand－launched－during－2012／77899791／.

［3］生物谷.Biosimilar ＆ FOB China 2011——生物仿制藥高峰論壇［EB／OL］.http：／／www.bioon.com／z／biosimilar／introduction.shtml.

［4］劉伯寧.治療性單抗與抗體產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵技術(shù)［J］.中國生物工程雜志，2013，33（5）：132－138.

［5］劉伯寧.用于重組抗體生產(chǎn)的細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)［J］.中國生物工程雜志，2013，33（7）：103－111.

［6］段須杰，劉睿，徐衛(wèi)濤，等.細(xì)胞培養(yǎng)工藝條件對抗體異質(zhì)性影響的研究進(jìn)展［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2013，29（12）：1880－1886.

［7］陸蘇飚，孫祥明，張?jiān)d.鄰苯二甲醛柱前衍生反相高效液相色譜法測定CHO細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度［J］.華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，30（4）：383－386.

［8］王志有，王海洋，臧娜.氨基酸分析方法的進(jìn)展［J］.材料導(dǎo)報(bào)，2005，19（11）：381－382.

［9］侯松嵋，孫敬，何紅波，等.AQC柱前衍生反相高效液相色譜法測定土壤中氨基酸［J］.分析化學(xué)，2006，34（10）：1395－1400.

［10］黃莉，吳小曼，紀(jì)宇，等.柱前衍生高效液相色譜法測定胎盤多肽注射液中的氨基酸［J］.中國生化藥物雜志，2012，33（4）：373－376.

［11］馬曉麗，孟磊，李琳琳，等.兩種柱前衍生反相高效液相色譜法測定血液和尿液中游離氨基酸［J］.氨基酸和生物資源，2012，34（3）：19－24.

［12］王永民，陳昭烈.動物細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的研究與設(shè)計(jì)方法［J］.中國生物工程雜志，2007，27（1）：110－114.

［13］Zhang H F，Wang H B，Liu M，et al.Rational development of a serum－free medium and fed－batch process for a GS－CHO cell line expressing recombinant antibody［J］.Cytotechnology，2013，65（3）：363－378.

［14］Ma N N，Ellet J，Okediadi C，et al.A single nutrient feed supports both chemically defined NSO and CHO fed－batch processes：Improved productivity and lactate metabolism［J］.Biotechnol Bioeng，2009，25（5）：1353－1363.

［15］Dietmair S，Hodson M P，Quek L E，et al.Metabolite profiling of CHO cells with different growth characteristics［J］.Biotechnol Bioeng，2012，109（6）：1404－1414.