張博雅，沈中陽，宋紅麗（.天津醫(yī)科大學第一中心臨床學院，天津 3009；.天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津 3009；）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是引起急慢性肝炎、肝硬化、原發(fā)性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的重要誘因之一［1］。肝細胞內(nèi)持續(xù)HBV感染以核內(nèi)共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的持續(xù)存在為特征，HBV cccDNA是病毒轉(zhuǎn)錄和復制的原始模板，并能長期穩(wěn)定存在于被感染肝細胞的核中，其長期存在與乙型肝炎慢性化有重要關(guān)系［2-3］。建立合適的HBV感染的動物模型很困難，這也制約著HBV導致的人類病毒性肝炎的發(fā)病機制、預后及HBV清除等方面的研究。目前，HBV相關(guān)性終末期肝病是我國肝移植的主要適應證。若肝移植術(shù)后不采用任何有效的預防措施，HBV再感染率較高［4］。建立合適、穩(wěn)定的HBV動物模型，有利于促進對肝移植后乙型肝炎的復發(fā)機制、抑制HBV再感染藥物及擴大肝移植供肝范圍等研究。隨著細胞培養(yǎng)、基因工程及其他相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，有關(guān)HBV感染的細胞模型及動物模型均已相繼建立。本文就HBV動物模型其建立方法及應用進行綜述。

1 HBV感染的大動物模型

于1985年有研究人員開始進行HBV類病毒在家養(yǎng)動物的感染情況的研究［5］，使用人診斷試劑盒檢測HBV，結(jié)果顯示大多家養(yǎng)動物的HBV血清標志物為陽性［6-7］。

1.1 HBV感染豬動物模型

Li等［8］提供一個肝臟慢性嗜肝病毒感染有關(guān)的模型，研究的目的是找到嗜肝病毒家族在豬流行存在的證據(jù)。篩選結(jié)果表明，總患病率為24.8%，結(jié)果意味著豬乙型肝炎病毒（swine hepatitis B virus，SHBV）可能是豬的病原體。SHBV的發(fā)現(xiàn)為嗜肝病毒進一步的研究提供了新的信息。然而到目前為止，這些類病毒沒有被確定，只有在中國發(fā)現(xiàn)相關(guān)的報告。

1.2 HBV感染靈長類動物模型

人乙型肝炎病毒（human hepatitis B virus，HHBV）宿主范圍非常狹窄，具有嗜肝性，所以建立合適的HBV感染的動物模型很困難。非人類的靈長類動物（黑猩猩、長臂猿等）可以感染HBV，且感染的HBV基因類型與感染人類的基本一樣［9］。

在1972年，London等［10］報道，HBV可以傳播給恒河猴，但隨后發(fā)現(xiàn)該研究結(jié)果無法證實。2002年，Gheit等［11］報道，巴巴里猿可能在肝內(nèi)轉(zhuǎn)染克隆人類HBV后發(fā)生急性感染，可檢測到HBV DNA和HBsAg。HBV在長臂猿種群中的病毒感染率可達23%～33%，在猩猩中的病毒感染率可達15%［12］。HBV感染動物模型中最有效的HBV仍是黑猩猩，但由于黑猩猩來源困難，并受動物倫理限制，模型難以推廣［13-14］。食蟹猴中自然、持續(xù)HBV感染的發(fā)現(xiàn)，首次為免疫學與人類相似的慢性HBV感染新的小型猿模型提供了證據(jù)［15］，這將對慢性乙型肝炎免疫治療方法的研究具有重要價值。

2 HBV感染的小動物模型及應用

2.1 鴨乙肝病毒（duck hepatitis B virus，DHBV）感染鴨乙肝模型及應用

DHBV感染的鴨乙肝模型提供了一個研究體內(nèi)抗HBV藥物活性和毒性的合適體系。趙克開等［16］選擇持續(xù)感染DHBV的2月齡上海麻鴨進行四氯化碳（CCl4）灌胃，然后處死動物取肝組織評價肝損傷程度。最終發(fā)現(xiàn)，在肝組織發(fā)生嚴重損傷時，血清中可以出現(xiàn)DHBV cccDNA，血清中DHBV cccDNA的檢出與肝組織損傷程度顯著相關(guān)。鴨乙肝模型在評估核苷類似物在體內(nèi)抗病毒效果中被證明是有用的。在DHBV感染的雛鴨體內(nèi)，短期使用病毒DNA聚合酶抑制劑可誘導病毒血癥的一過性降低，但不能清除肝內(nèi)的cccDNA，在治療停止后病毒復制會有明顯的反彈［17］。DHBV感染鴨乙肝模型是細胞表面病毒受體、病毒清除機制以及篩選新的抗病毒藥物的合適動物模型［18］。但由于DHBV只感染鴨而不能感染人，所以此模型仍不能很好地再現(xiàn)人的HBV感染過程。

2.2 HBV感染樹鼩模型及應用

多項研究表明，樹鼩肝臟對人類HBV有著易感性［19］。從20世紀80年代起，國內(nèi)外即有報到證實樹鼩接種HBV后可在肝臟中檢測到HBV感染和復制情況。樹鼩的血清和肝細胞有人HBV標志物，利用血清學、免疫組織化學、分子雜交以及電鏡檢查等技術(shù)，在接種了人HBV的樹鼩血中可查見HBsAg及Dane顆粒，在肝細胞也檢測出HBsAg、HBcAg及HBV DNA，表明樹鼩可感染人HBV形成動物模型且感染率較高，但是感染為一過性，不能使其形成長期的HBV攜帶者［20］。

Ruan等［21］建立了長期感染HBV的樹鼩模型，定期收集血清和肝臟組織樣本，顯示出腫脹的脂肪變性和嗜酸性變性，并有淋巴細胞浸潤和增生，小膽管口觀察顯示多個壞死區(qū)域融合形成橋接壞死、纖維化以及巨紅細胞癥。肝組織病理學變化觀察到長期感染HBV的樹鼩與HBV感染的人類相似，可以用樹鼩代表新型HBV感染的動物模型。周勇等［22］經(jīng)大隱靜脈，用螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase，F(xiàn)luc）和 β- 半乳糖苷酶（β- galactosidase，β-Ga1）作為報告基因，通過樹鼩大隱靜脈將報告基因用水動力注射方法導入樹鼩肝臟，通過活體成像和β-Gal染色來觀察水動力轉(zhuǎn)染效果。將pHBV1.2質(zhì)粒用水動力注射方法轉(zhuǎn)入樹鼩肝臟，確定了水動力轉(zhuǎn)染樹鼩肝臟的條件，注射容量越大，速度越快，肝臟轉(zhuǎn)染效率越高，同時造成的肝臟損傷越大，外源基因表達效率也越高。曾揚等［23］通過大腿內(nèi)側(cè)靜脈注射將攜帶有1.3HBV的重組8型腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus 8，rAAV8-1.3HBV）導入樹鼩肝臟，熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測樹鼩肝臟和血清中HBV DNA，55天時肝組織HBV DNA拷貝數(shù)仍可達到104～105IU/ml。說明重組8型腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus 8，rAAV8）所攜帶的HBV基因組高效專一導入樹鼩肝細胞并復制表達，也成功建立HBV急性感染樹鼩模型。2009年，楊芳等［24］用新生樹鼩感染人HBV，結(jié)論為新生樹鼩能夠長期感染HBV，并且HBV能夠在樹鼩體內(nèi)穩(wěn)定復制和長期存在。

2.3 HBV感染小鼠模型

小鼠作為實驗室最常使用的動物，易于飼養(yǎng)，遺傳背景清楚，全序基因組已完全確定，這決定了小鼠是最理想的動物模型。雖然普通小鼠無法直接感染HBV，但是通過多種分子生物學手段，可以建立適合于各種研究目的HBV小鼠模型，這為HBV的研究提供了非常有用的工具。

2.3.1 HBV人-鼠嵌合肝模型

將人肝細胞移植到鼠的肝臟構(gòu)建“人鼠嵌合肝”模型可以模擬HBV復制的全過程，不但解決肝炎病毒感染的種屬特異性問題，而且可用于抗HBV治療和細胞受體的研究及了解肝臟再生和細胞分化［25］。HBV-Trimera小鼠是第一個能支持HBV復制的人鼠嵌合模型。Ilan等［26］給正常小鼠致死劑量射線全身照射以消除小鼠的免疫活性，再把重癥聯(lián)合免疫缺陷（SClD）鼠的骨髓細胞立即靜脈注射移植給該小鼠，使后者的骨髓細胞及紅細胞系得以再生，最后將離體感染HBV的人肝組織移植到該小鼠腎被膜下或耳廓部，構(gòu)建成HBV三合體小鼠模型。研究發(fā)現(xiàn)，在移植1個月后，三合體小鼠體內(nèi)存活的人肝細胞可重現(xiàn)HBV自然感染人體時的復制過程。約有80%的小鼠可以檢測到病毒血癥，但是小鼠血清中的病毒滴度僅為105拷貝/ml血液，且持續(xù)時間也只有20天，可用于短期研究藥物抗病毒活性分析。

uPA/SCID小鼠模型是目前最好的HBV感染復制模型，該模型小鼠因為被轉(zhuǎn)入具有肝臟毒性的uPA 基 因（urokinase plasminogen activator， uPA），自身的肝細胞生長受到抑制，而植入的肝細胞具有生長優(yōu)勢，加之該小鼠無免疫排斥能力，適合于移植肝細胞的生長［27］。將原代人肝細胞移植入Alb-uPA轉(zhuǎn)基因鼠和嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠（Cb-17/SCID/bg）雜交而成的uPA/SCID小鼠建立嵌合肝后，發(fā)現(xiàn)人的肝細胞可以占到整個肝臟的絕大部分，該肝臟近乎完全人源化。然后通過將HBV DNA陽性人的血清接種到該鼠，可以檢測到達1010拷貝/ml的高水平的病毒血癥，而且持續(xù)達5 個月之久［28-29］。

由于uPA/SCID小鼠沒有免疫功能，對于研究HBV的致病機制以及HBV與宿主免疫系統(tǒng)的相互關(guān)系仍然是一個難以克服的問題，一種間接的解決方法就是使用人抗HBV免疫細胞對小鼠進行處理，失去uPA基因的小鼠肝臟重新獲得生長優(yōu)勢，結(jié)果會導致小鼠肝細胞比例增加，實驗發(fā)現(xiàn)人肝細胞所占總肝細胞的比例直接影響了血清HBV的含量。uPA/SCID小鼠的飼養(yǎng)和繁殖也是一個問題，由于沒有細胞免疫和體液免疫，加上肝臟不能正常發(fā)育，因此出生死亡率很高［30］。

2.3.2 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型

HBV感染具有嚴格的種屬特異性，但其復制并無種屬特異性，因而可以通過轉(zhuǎn)基因方法將人HBV基因轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細胞，使HBV基因進入小鼠體內(nèi)并在肝臟和腎臟中復制和分泌HBV病毒。除HBV全基因組轉(zhuǎn)基因小鼠外，還有HBV部分片段轉(zhuǎn)基因小鼠模型。Madden等［31］和Zhu等［32］報道HBx轉(zhuǎn)基因小鼠可導致HCC，但HBx并不單獨致癌，而是與其他致癌基因和環(huán)境致癌物共同致癌，其致癌機制與抑癌基因p53相關(guān)。在轉(zhuǎn)大S基因小鼠中發(fā)現(xiàn)，大S基因表達導致大量S蛋白堆積于肝細胞內(nèi)，產(chǎn)生肝細胞毒性及代償性增生，直至引發(fā)肝癌。另有實驗證實，全長的preS/S基因產(chǎn)物不具有反式激活作用，而presl、pres2區(qū)突變的preS/S基因的表達產(chǎn)物誘導DNA的氧化損傷，可能與HBV相關(guān)性HCC的發(fā)生有關(guān)［33］。

2.3.2.1 高壓水動力注射法造HBV小鼠模型

水動力注射法是Zhang等［34］提出的，通過尾靜脈注射裸DNA小鼠使外源基因在肝內(nèi)表達的一種技術(shù)方法。Huang等［35］采用水動力法注射HBV質(zhì)粒后在C57BL/6小鼠中建立HBV慢性感染模型，將1.2個拷貝HBV基因組克隆至重組的腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）載體中，C57BL/6小鼠注射。結(jié)果約40%注射鼠HBV表面抗原表達長達6個月，而HBV的轉(zhuǎn)錄、復制中間體及蛋白的表達在1年之內(nèi)都存在，說明小鼠HBV持續(xù)感染模型的構(gòu)建是成功的。

盡管利用C57BL/6小鼠并采用水動力法制備HBV小鼠模型獲得成功，但是許多相關(guān)研究還存在HBV病毒在體內(nèi)短時間存在的問題。郭燕菊等［36］構(gòu)建了含腺相關(guān)病毒倒轉(zhuǎn)末端重復序列元件與包含1.3個拷貝HBV基因組（ayw 亞型）的HBV表達質(zhì)粒（pAAV-HBV1.3），并將pAAV-HBV1.3質(zhì)粒經(jīng)高壓水動力法尾靜脈注射C57BL/6小鼠，正常免疫狀態(tài)下，檢測血清及肝組織的HBV抗原及病毒載量均為陽性，且與對照組差異顯著（P＜0.01，P＜0.05）。最后采用腹腔注射免疫抑制劑地塞米松注射液（dexamethasone， DEX），使小鼠處于免疫抑制狀態(tài)下，可用高壓水動力法建立了乙肝病毒轉(zhuǎn)染小鼠模型，在60天仍可檢測到HBsAg、HBeAg的表達。以上結(jié)果表明，通過高壓水動力法建立的急性乙肝小鼠模型，通過抑制小鼠免疫狀態(tài)，可延長病毒在小鼠體內(nèi)存留時間。

2.3.2.2 重組腺病毒轉(zhuǎn)導的HBV小鼠模型

HBV轉(zhuǎn)基因小鼠是目前較為常用的攜帶HBV基因組的小鼠模型，但轉(zhuǎn)基因小鼠的HBV整合在宿主染色體中，不形成cccDNA，而cccDNA是前基因組及各種長度的病毒RNA的轉(zhuǎn)錄模板，在HBV復制周期中起著重要作用［37］。腺病毒載體是一種非常有效的轉(zhuǎn)基因載體，具有高效率、高滴度、低致病性及不整合宿主細胞染色體等優(yōu)點，廣泛應用于基因治療及疫苗的研究。HBV具有嚴格的種屬特異性，只感染人及少數(shù)靈長類動物，而腺病毒載體可感染分裂期和靜止期的細胞，可以轉(zhuǎn)導包括肝細胞在內(nèi)的多種細胞，因而可以將HBV基因?qū)氲礁渭毎靶∈篌w內(nèi)［38］。

基于AAV8病毒的肝臟高親嗜性，董小巖等［39］用高嗜肝性的重組8型腺相關(guān)病毒（Recombinant adeno-associated virus type 8，rAAV8）載體攜帶1.3個拷貝HBV基因組（ayw 亞型）體內(nèi)轉(zhuǎn)導法，建立持續(xù)表達HBV抗原的C57BL/6 小鼠模型。檢測HBV DNA拷貝數(shù)顯示，小鼠血清中HBV DNA的水平＞103拷貝/ml，肝臟中＞2.5×106拷貝/g，在小鼠肝組織中可檢測到環(huán)化HBV DNA，提示AAV8 載體攜帶的線性HBV DNA可成功恢復成HBV的環(huán)化形式。結(jié)果表明，本研究成功地建立了HBV在肝內(nèi)穩(wěn)定復制并持續(xù)表達HBV抗原的小鼠模型，為進一步研究HBV慢性持續(xù)感染的機制與應用于藥物開發(fā)以及疫苗評價打下了基礎(chǔ)。隨后王國婧等［40］探索用重組rAAV8載體攜帶1.3個拷貝乙型肝炎病毒（rAAV8-1.3HBV）介導的HBV持續(xù)感染小鼠模型以評價核苷酸類似物抗病毒藥物恩替卡韋（entecavir，ETV）及拉米夫定（lamivudine，LAM）的抗病毒效果。結(jié)果表明，ETV和LAM能有效抑制模型小鼠中HBV病毒的復制，而對HBeAg和HBsAg表達水平無明顯影響；提示AAV8-1.3HBV介導的HBV持續(xù)感染小鼠模型制備簡單，成模率高，可有效體現(xiàn)出ETV和LAM的抗HBV作用效果，從而用于核苷酸類似物抗HBV藥物的篩查。

3 結(jié) 語

HBV宿主范圍狹窄且具有嗜肝性，所以建立合適的HBV感染的動物模型很困難。研究人員在豬體內(nèi)僅找到SHBV，認為可能是豬的病原體，然而到目前為止，這些種類病毒沒有被確定，只有在中國發(fā)現(xiàn)過相關(guān)的報告。非人類的靈長類動物（黑猩猩、長臂猿等）感染的HBV基因類型與感染人類的基本一樣，最有效的感染動物模型是黑猩猩，但由于黑猩猩來源困難，并受動物倫理限制，模型難以推廣。食蟹猴自然、持續(xù)感染HBV的模型的發(fā)現(xiàn)，首次為免疫學與人類相似的慢性HBV感染的新的小型猿模型提供了證據(jù)。

DHBV感染的鴨乙肝模型提供了一個研究體內(nèi)抗HBV藥物活性和毒性的合適體系，但由于DHBV只感染鴨而不能感染人，所以此模型仍不能很好地再現(xiàn)人的HBV感染過程。研究表示，樹鼩肝臟對人類HBV有著易感性，研究人員成功建立了HBV急性感染樹鼩模型，但感染僅為一過性。用新生樹鼩感染人HBV表明，新生樹鼩能夠長期感染HBV，并且HBV能夠在樹鼩體內(nèi)穩(wěn)定復制和長期存在。

雖然普通小鼠無法直接感染HBV，但是通過多種多樣的分子生物學的手段，卻可以建立適合于各種研究的HBV小鼠模型，如HBV人-鼠嵌合肝模型和HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型。HBV人-鼠嵌合肝模型可以模擬HBV復制的全過程，但嵌合小鼠沒有免疫功能，對于研究HBV的致病機制以及HBV與宿主免疫系統(tǒng)的相互關(guān)系仍然是一個難以克服的問題。HBV的復制并沒有種屬特異性，因而可以通過轉(zhuǎn)基因的方法將人HBV基因轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細胞，使HBV基因進入小鼠體內(nèi)并在肝臟和腎臟中復制和分泌HBV病毒。腺病毒載體可以轉(zhuǎn)導包括肝細胞在內(nèi)的多種細胞，因而可將HBV基因?qū)氲礁渭毎靶∈篌w內(nèi)。目前已成功地建立了HBV病毒在肝內(nèi)穩(wěn)定復制并持續(xù)表達HBV抗原的小鼠模型，為進一步研究HBV慢性持續(xù)感染的機制與應用于藥物以及疫苗評價打下了基礎(chǔ)。