宮玲玲 李俊玲 李會(huì)榮 張 蕓 強(qiáng) 莉 張 瑋（山東省飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所 山東 濟(jì)南 250022）

反芻動(dòng)物飼料中牛羊源性成分檢測(cè)污染控制及應(yīng)對(duì)措施

宮玲玲 李俊玲 李會(huì)榮 張 蕓 強(qiáng) 莉 張 瑋（山東省飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所 山東 濟(jì)南 250022）

為打擊反芻動(dòng)物飼料中添加牛羊源性成分的違法行為，切斷瘋牛病通過(guò)飼料的傳播途徑，防范瘋牛病在我國(guó)的發(fā)生，確保牛羊安全和食品安全，對(duì)芻動(dòng)物飼料進(jìn)行牛羊源性成分的檢測(cè)。然而牛羊源性成分檢測(cè)步驟繁多，檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜，做好污染控制對(duì)檢測(cè)成敗至關(guān)重要。根據(jù)多年來(lái)從事牛羊源性成分檢測(cè)總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)，下面從以下幾個(gè)方面介紹避免交叉污染的控制措施以及出現(xiàn)污染后的應(yīng)對(duì)措施。

1 反芻動(dòng)物飼料中牛羊源性成分檢測(cè)交叉污染的控制

1.1 合理分隔試驗(yàn)區(qū) （1）樣品處理區(qū)(樣品粉碎區(qū)和稱樣區(qū))；（2）核酸提取區(qū)；（3）PCR反應(yīng)液制備區(qū)；（4）擴(kuò)增區(qū)；（5）PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其試驗(yàn)用品及取樣槍應(yīng)專用。

1.2 槍頭、離心管等消毒滅菌 槍頭、離心管、配反應(yīng)體系所用的水等用前經(jīng)過(guò)高溫滅菌，一般120℃ 30min即可。注意不要和微生物共用滅菌鍋，以免被培養(yǎng)基中的牛肉膏污染。

1.3 樣品的粉碎 用較小的粉碎機(jī)粉碎反芻動(dòng)物飼料，便于清理。粉碎機(jī)放置在能排風(fēng)的環(huán)境中。粉碎機(jī)先粉碎玉米碴或麩皮4～5遍，再粉碎經(jīng)4分法分取的樣品3遍棄掉，收集第4遍粉碎的全部樣品混勻裝袋備用。注意粉碎完每一遍都要用氣槍、毛刷將粉碎機(jī)清理干凈。一份樣品使用一套工具，包括手套，可使用廢棄報(bào)紙代替塑料布，用后廢棄。

1.4 稱樣 稱樣時(shí)一個(gè)樣品用一把勺子，也可用稱樣紙折成小條代替勺子。稱樣時(shí)戴手套，如樣品沾到手套上要及時(shí)更換。

1.5 核酸提取 提取液分裝成小包裝。加提取液時(shí)一樣一槍頭，避免交叉污染。

1.6 PCR反應(yīng)液制備 在配制過(guò)程中，注意加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染，所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，避免反復(fù)凍融影響效果。

1.7 擴(kuò)增 牛羊源性成分設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照。（1）設(shè)立牛羊源性成分陽(yáng)性和陰性對(duì)照和試劑對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的最低量的標(biāo)準(zhǔn)核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對(duì)照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對(duì)照；（2）牛羊源性成分陰性對(duì)照。包括：①樣品對(duì)照：被檢的樣品是飼料就用鑒定后的陰性飼料作對(duì)照；②試劑對(duì)照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。

1.8 牛羊源性成分PCR產(chǎn)物鑒定 PCR產(chǎn)物拷貝量大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可形成假陽(yáng)性。在電泳上樣時(shí)，擴(kuò)增后的PCR管蓋小心開(kāi)啟。PCR產(chǎn)物鑒定時(shí)使用的EB(溴化乙錠)是一種致癌劑，對(duì)操作者和環(huán)境都有一定的污染。為了操作者的健康和避免對(duì)環(huán)境造成污染，選用EB替代物，如Goldview等試劑。我們?cè)谠囼?yàn)過(guò)程中做了多次EB及EB替代物的比對(duì)試驗(yàn)，表明二者的染色效果基本相同。

2 反芻動(dòng)物飼料中牛羊源性成分檢測(cè)污染后的應(yīng)對(duì)措施

反芻動(dòng)物飼料中牛羊源性成分檢測(cè)出現(xiàn)污染后，可能所用耗材、稱樣、核酸提取、試劑、反應(yīng)體系等被污染；要從操作環(huán)境、樣品粉碎、稱樣、核酸提取、反應(yīng)體系的制備、擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物鑒定等各個(gè)環(huán)節(jié)逐一排除。（1）操作環(huán)境凈度不夠。環(huán)境中存在氣溶膠、陽(yáng)性核酸、陽(yáng)性PCR產(chǎn)物等。采取措施：桌面用酒精擦試。房間開(kāi)窗通風(fēng)一周左右。（2）樣品粉碎時(shí)污染。用玉米碴、要粉碎的樣品多過(guò)幾次粉碎機(jī)，每次粉碎完都用毛刷、氣槍清理干凈。（3）用酒精擦凈稱樣用的天平，稱樣時(shí)帶一次性手套，并及時(shí)更換。（4）操作儀器和實(shí)驗(yàn)用具消毒不嚴(yán)。耗材、加樣槍、容器、雙蒸水等嚴(yán)格消毒。離心機(jī)的轉(zhuǎn)子、離心孔、內(nèi)腔用酒精消毒。（5）核酸提取時(shí)試劑污染。更換試劑。（6）反應(yīng)體系污染。更換所有的試劑及引物。（7）擴(kuò)增時(shí)PCR儀污染。用酒精擦拭PCR儀的小孔及蓋子。（8）PCR產(chǎn)物鑒定時(shí)污染。更換電泳緩沖液、上樣緩沖液及Mark等。

S816.17

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1007-1733(2014)11-0040-01

2014–08–08）