柳忠玉趙樹進

（1. 長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，荊州 434025；2. 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，廣州 510010）

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的虎杖莖尖轉(zhuǎn)化研究

柳忠玉1趙樹進2

（1. 長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，荊州 434025；2. 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，廣州 510010）

為了建立根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的虎杖莖尖遺傳轉(zhuǎn)化體系，以虎杖的莖尖為轉(zhuǎn)化受體，研究了攜帶白藜蘆醇合酶基因（PcRS）的根癌農(nóng)桿菌載體介導(dǎo)的虎杖遺傳轉(zhuǎn)化若干因素對轉(zhuǎn)化效果的影響。結(jié)果顯示，較適宜的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)為預(yù)培養(yǎng)2 d，農(nóng)桿菌菌液（OD600值為0.6）侵染10 min，共培養(yǎng)3 d，在含8 mg/L 潮霉素的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽。利用該體系從 300 塊莖尖外植體中共轉(zhuǎn)化獲得 15株抗性再生植株，經(jīng) PCR 和 Southern 雜交檢測，有 6 株虎杖的基因組中已整合進了目的基因。

虎杖 莖尖 根癌農(nóng)桿菌 遺傳轉(zhuǎn)化

虎杖（Polygonum cuspidatumSieb. et Zucc.）是蓼科多年生草本植物，根或根莖入藥?；⒄雀泻写罅烤哂兄委熜в玫拇渭壌x物，如白藜蘆醇、虎杖苷、蒽醌類等。其中白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗衰老、保護心血管系統(tǒng)等廣泛的生物學(xué)功能［1-3］。虎杖已取代葡萄，成為最重要的白藜蘆醇藥源植物。

盡管虎杖具有重要的藥用價值和經(jīng)濟價值，但其分子遺傳和基因組的研究仍十分缺乏。最近，郝大程等［4］利用測序技術(shù)分析虎杖根轉(zhuǎn)錄組特性，識別出與白藜蘆醇、蒽醌及其糖苷生物合成有關(guān)的基因，并且發(fā)現(xiàn)大量序列代表轉(zhuǎn)座子（TEs）和單重復(fù)序列（SSRs），這些結(jié)果有望用于虎杖植株的遺傳改良。在白藜蘆醇的生物合成途徑中，白藜蘆醇合酶是一個關(guān)鍵限速酶，在植物中過量表達該基因可以提高白藜蘆醇含量或增強植物抗逆性［5］。建立快速高效的虎杖遺傳轉(zhuǎn)化體系顯得尤為迫切，但是當(dāng)前關(guān)于虎杖遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究仍未深入和系統(tǒng)?，F(xiàn)有的研究表明，虎杖是含酚類物質(zhì)較多的藥用植物，其愈傷組織誘導(dǎo)率低并且基部易褐化，不利于進一步的生長及分化［6］。利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)虎杖毛狀根的產(chǎn)生，能提高毛狀根中活性成分含量，但存在陽性毛狀根生長緩慢，容易褐化等問題［7，8］。利用植物莖尖為轉(zhuǎn)化受體，不必經(jīng)過誘導(dǎo)愈傷及分化成苗階段，轉(zhuǎn)化后可以直接成苗，莖尖轉(zhuǎn)化已成功用于單子葉或雙子葉植物，如小麥、棉花、玉米、太子參和高粱等［9-13］，而以虎杖莖尖為受體進行遺傳轉(zhuǎn)化的研究尚未見報道。

本研究以虎杖莖尖為轉(zhuǎn)化受體，研究不同因素對莖尖遺傳轉(zhuǎn)化的影響，以期為利用虎杖莖尖建立優(yōu)良的轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)奠定重要的技術(shù)基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)，并為今后虎杖基因的分子生物學(xué)研究和品種改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 虎杖植株由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心提供。

1.1.2 載體和菌株 本研究所用植物過量表達載體pCAMBIA1380-35S-PcRS為筆者構(gòu)建［14］，含有虎杖白藜蘆醇合酶基因PcRS（Polygonum cuspidatum resveratrol synthase）和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。根癌農(nóng)桿菌EHA105由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物基因組學(xué)與生物技術(shù)重點實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配方 誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS + 0.05 mg/L TDZ（Thidiazuron，苯基噻二唑基脲）+ 0.5 mg/L NAA（naphthlcetic acid，萘乙酸），pH5.8。共培養(yǎng)基：MS+ 0.05 mg/L TDZ + 0.5 mg/L NAA + 40 mg/L AS（Acetosyringone，乙酰丁香酮），pH5.5。篩選培養(yǎng)基：MS+ 0.05 mg/L TDZ + 0.5 mg/L NAA + 6 mg/L Hyg（hygromycin，潮霉素），pH5.8。增殖培養(yǎng)基：MS + 0.1 mg/L CPPU（N-（2-chloro-4-pyridyl）-N'-phenylurea，氯吡苯脲）+ 1.0 mg/L NAA + 6 mg/L Hyg，pH5.8。根誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS +1.0 mg/L NAA + 0.5% 活性炭，pH5.8。

1.2.2 虎杖無菌苗的獲得與莖尖外植體制備 將虎杖嫩莖剪成長 5 cm左右的莖段，沖洗約1 h，移到超凈工作臺上，用 70%的乙醇消毒 30 s，1.5%次氯酸鈉振蕩洗滌 20 min，再用無菌水沖洗 4-5遍。然后切取帶腋芽的莖段 1 cm左右，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽的生長。將誘導(dǎo)形成的叢生芽分離成單個芽，繼續(xù)培養(yǎng)成苗。取虎杖無菌試管苗放到解剖顯微鏡下，剝掉生長點附近包裹的葉片，當(dāng)莖尖裸露出來后用接種針輕輕劃傷頂端分生組織，然后把附帶有莖尖的0.5 cm左右長的莖段切下來備用。

1.2.3 虎杖莖尖潮霉素敏感性試驗 在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加潮霉素，將潮霉素的濃度設(shè)為0、2、4、8、15 和 30 mg/L 共 6 個水平，每個處理接入 100個虎杖莖尖外植體，試驗重復(fù) 3 次，培養(yǎng) 15 d，觀察外植體的色澤變化、生長狀態(tài)和存活情況。

1.2.4 轉(zhuǎn)化條件的選擇 分別在保持其他因素相同的條件下進行單因素試驗，評價各因素對農(nóng)桿菌侵染虎杖莖尖的影響效果，以確定最佳的侵染條件。將處理好的虎杖莖尖在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng) 1-8 d。將農(nóng)桿菌懸浮液OD600值調(diào)整為 0.2-0.8，侵染經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的莖尖受體5-25 min。侵染結(jié)束后用滅菌濾紙吸干多余菌液，置于墊有一張滅菌濾紙的共培養(yǎng)基上，黑暗中共培養(yǎng) 2-5 d。共培養(yǎng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上，將篩選獲得的抗性芽轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基生長至 3-5 cm高，再轉(zhuǎn)至根誘導(dǎo)培養(yǎng)基使其長成完整植株。侵染后受體在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光/暗為 16 h/8 h，溫度 22-25℃。所有試驗均為每個處理檢測 100 個莖尖，重復(fù) 3次。采用潮霉素抗性芽的分化率（%）和增殖系數(shù)作為評價轉(zhuǎn)化效果的指標(biāo)，其計算方法如下：

分化率（%）= 再生抗性芽的莖尖數(shù)/ 接種莖尖數(shù)×100%

增殖系數(shù)= 莖尖再生抗性芽總數(shù)/ 再生抗性芽的莖尖數(shù)

1.2.5 轉(zhuǎn)基因虎杖的PCR檢測 用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因虎杖和野生型虎杖的葉片基因組DNA。用潮霉素基因特異引物HPTf（5'-CGCCGATGGTTTCTACAA-3'）和HPTr（5'-GGCGTCGGTTTCCACTAT-3'）進行PCR檢測。PCR擴增條件為：94℃ 預(yù)變性 2 min；94℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，共28個循環(huán)；最后 72℃ 延伸 10 min。預(yù)期擴增片段大小為500 bp。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交 對PCR鑒定為陽性的轉(zhuǎn)化植株和野生植株，取 30 μg虎杖基因組DNA，經(jīng)EcoR I 酶切DNA，以引物HPTf和HPTr擴增的潮霉素基因為探針模板，用地高辛隨機引物標(biāo)記試劑盒進行標(biāo)記。按照文獻［14］方法進行Southern雜交。

2 結(jié)果

2.1 虎杖莖尖對潮霉素的敏感性

本研究以潮霉素作為篩選標(biāo)記，為有效篩選抗性苗，將制備的莖尖分別置于不同濃度梯度的潮霉素培養(yǎng)基上進行篩選，觀察外植體的色澤變化、生長狀態(tài)和存活情況，試驗結(jié)果見表1和圖1。從表1和圖1結(jié)果可以看出，對照組的虎杖莖尖生長迅速，并分化出綠色的芽，芽的存活率為 95.6 %；隨著潮霉素濃度的增高外植體生長減緩，分化出的芽弱小且存活率逐漸降低至 23.7%；高濃度潮霉素處理造成植物組織失綠褐化并迅速死亡。當(dāng)潮霉素濃度在4 mg/L 以下不能有效抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長，容易造成大量非轉(zhuǎn)化體的逃逸；潮霉素濃度在 15 mg/L以上時，外植體迅速死亡將影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的正常生長；而潮霉素濃度 8 mg/L 處理既能有效抑制非轉(zhuǎn)化組織的生長，又不至于造成細(xì)胞迅速死亡，所以潮霉素濃度 8 mg/L是莖尖轉(zhuǎn)化外植體篩選的適宜濃度。

2.2 預(yù)培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化的影響

將虎杖莖尖分別預(yù)培養(yǎng) 1、2、4 和 8 d，侵染菌液濃度OD600值約 0.4，侵染莖尖 10 min，共培養(yǎng) 3 d，統(tǒng)計轉(zhuǎn)化后獲得的抗性芽百分率及增殖系數(shù)見表2。結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)念A(yù)培養(yǎng)可以提高莖尖的再生分化率。預(yù)培養(yǎng) 1 d 時的再生分化率較低（2.3%），再生芽生長細(xì)弱，不利于潮霉素抗性苗的獲得；預(yù)培養(yǎng) 2 d 的莖尖再生分化率最高（4.7 %），再生芽生長健壯；預(yù)培養(yǎng) 8 d 時的再生分化率反而下降（2.4 %）。所以選擇 2 d 作為預(yù)培養(yǎng)的時間。

2.3 菌液濃度對虎杖遺傳轉(zhuǎn)化的影響

將農(nóng)桿菌的濃度OD600稀釋為 0.2、0.4、0.6 和0.8，侵染預(yù)培養(yǎng) 2 d 的莖尖 10 min，共培養(yǎng) 3 d，以轉(zhuǎn)化后獲得的抗性芽百分率及增殖系數(shù)作為評價指標(biāo)（表3）。本研究中不同的菌液侵染濃度對侵染效果的影響顯著。菌液侵染濃度OD600在 0.2 時分化率只有2.4 %，濃度為 0.6 時的分化率達 5.5 %，之后隨著濃度的增高分化率降低。故將農(nóng)桿菌菌液濃度稀釋至 0.6 進行侵染。

2.4 侵染時間對虎杖遺傳轉(zhuǎn)化的影響

分別侵染預(yù)培養(yǎng) 2 d 的莖尖 5、10、15、20 和25 min，菌液濃度OD600約 0.6，共培養(yǎng)3 d，以轉(zhuǎn)化后獲得的抗性芽百分率及增殖系數(shù)作為評價指標(biāo)（表4）。經(jīng) 10 min 侵染后的分化率與其他侵染處理都有顯著差異，侵染5、20 和25 min 之間的差異不顯著。侵染 10 min的再生分化率達5.3%，增殖系數(shù)較高且再生芽強壯，故將侵染時間選擇在10 min。

2.5 共培養(yǎng)時間對虎杖遺傳轉(zhuǎn)化的影響

用OD600值約 0.6 的菌液侵染預(yù)培養(yǎng) 2 d 的莖尖10 min，分別于黑暗中共培養(yǎng) 2、3、4 和 5 d，以轉(zhuǎn)化后獲得的抗性芽百分率及增殖系數(shù)作為評價指標(biāo)（表5）。不同共培養(yǎng)時間對侵染結(jié)果的影響差異較大，2 d時分化率較低（2.4 %），經(jīng)3 d 共培養(yǎng)后分化率可達 5.6%，但是共培養(yǎng) 5 d 后的分化率又降到2.9 %。本試驗條件下選擇在侵染后共培養(yǎng)3 d 較為適宜，有利于獲得較多生長健壯的抗性再生芽。

2.6 虎杖轉(zhuǎn)化苗的獲得

虎杖莖尖遺傳轉(zhuǎn)化各階段如圖 2所示。剝離好的莖尖經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后（圖 2-A），進行農(nóng)桿菌侵染，并共培養(yǎng)3 d（圖 2-B）；然后轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上篩選（圖 2-C），不具潮霉素抗性的莖尖逐漸褐化死亡；將經(jīng)篩選后成活的莖尖轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基上（圖2-D），促進芽增殖與伸長；待幼苗生長至 3-5 cm高，轉(zhuǎn)至根誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行生根（圖 2-E）；最后移栽到盆土中生長（圖 2-F）。

2.7 轉(zhuǎn)基因虎杖的PCR檢測

按照上述遺傳轉(zhuǎn)化體系，剝?nèi)』⒄惹o尖 300個，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化、篩選，獲得了移栽成活的抗性植株共 15株，潮霉素基因的PCR檢測（圖3）顯示其中 6株為轉(zhuǎn)基因的陽性植株，這些轉(zhuǎn)基因植株均含有預(yù)期的約 500 bp的DNA片段。

2.8 轉(zhuǎn)基因虎杖的Southern雜交

選取PCR鑒定為陽性的轉(zhuǎn)基因虎杖植株，提取葉片基因組DNA，經(jīng)EcoR I酶切、電泳、轉(zhuǎn)膜后以潮霉素基因為雜交探針的Southern雜交結(jié)果（圖4）表明，在這 6個株系中均檢測到雜交條帶，而野生虎杖沒有雜交信號。因此，這些轉(zhuǎn)基因虎杖株系的基因組中確實整合了目的基因。

3 討論

本試驗前期采用葉盤法和愈傷組織侵染方法進行轉(zhuǎn)化遇到諸多困難：葉盤經(jīng)過不同激素組合誘導(dǎo)，較難誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽；虎杖是含酚類物質(zhì)較高的藥用植物，其愈傷組織易褐化、難分化成苗。而植物莖尖具有變異性小、有利于保持原有材料的優(yōu)良性狀等特點，國內(nèi)外很多學(xué)者利用莖尖或莖尖分生組織獲得了轉(zhuǎn)基因植株［9-13］。因此，本試驗選擇莖尖為轉(zhuǎn)化受體，探討了影響虎杖莖尖遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素。

潮霉素的毒性機理是干擾植物細(xì)胞葉綠體和線粒體中的核糖體與延長因子EF-2 的結(jié)合，從而抑制肽鏈的延長。潮霉素濃度過低易造成假陽性率過高；潮霉素濃度過高，可能導(dǎo)致不能得到足量的轉(zhuǎn)基因植株。在對植物材料進行基因轉(zhuǎn)化之前，對受體材料進行潮霉素敏感性試驗是十分必要的。段曉昱等［15］的研究表明向日葵莖尖、子葉、胚軸不同部位轉(zhuǎn)化外植體對潮霉素敏感性存在一定的差異；大豆品種黑農(nóng) 35的子葉節(jié)分化的潮霉素篩選濃度為 6 mg/L，而叢生芽生根的潮霉素篩選濃度降低為2 mg/L［16］；可見對于同一種植物，不同的外植體對抗生素的敏感性也是不同的。本研究通過虎杖莖尖對潮霉素的敏感性試驗，確定了虎杖莖尖轉(zhuǎn)化的適宜濃度為 8 mg/L。在連續(xù)篩選過程中一直使用同一濃度進行篩選，這可能是造成轉(zhuǎn)化率低的原因之一。在后續(xù)的研究中可以考察虎杖不同部位外植體對潮霉素的敏感性，采用梯度添加篩選劑的方式來提高轉(zhuǎn)化率。

在植物遺傳轉(zhuǎn)化中，預(yù)培養(yǎng)可以促進細(xì)胞分裂，處于分裂狀態(tài)的細(xì)胞更易整合外源DNA，從而提高轉(zhuǎn)化率；另一方面預(yù)培養(yǎng)能減少褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生［17］。趙福永［18］對含酚類物質(zhì)較高的棉花進行了預(yù)培養(yǎng)處理，根誘導(dǎo)階段根誘導(dǎo)率要比對照組高 15%左右?；⒄纫彩呛宇愇镔|(zhì)較高的植物，本試驗中預(yù)培養(yǎng)2 d 是最佳處理，而預(yù)培養(yǎng)時間超過 8 d，轉(zhuǎn)化率顯著下降。轉(zhuǎn)化率隨著預(yù)培養(yǎng)時間的延長先增加后下降，在高粱莖尖轉(zhuǎn)化中也有類似報道，其原因可能是預(yù)培養(yǎng)時間過短莖尖傷口未愈合易受農(nóng)桿菌的侵害；預(yù)培養(yǎng)時間過長莖尖傷口細(xì)胞已不能提供足夠的誘導(dǎo)農(nóng)桿菌貼壁的受體，或由于莖尖分生組織細(xì)胞的分裂速度減緩，進入細(xì)胞核的T-DNA 量減少［13］。王沛雅等［19］對河北楊的遺傳轉(zhuǎn)化研究表明，預(yù)培養(yǎng)2 d以上可以顯著提高轉(zhuǎn)化率，但預(yù)培養(yǎng) 2-8 d 間的差異不顯著，轉(zhuǎn)化率并不表現(xiàn)出隨著預(yù)培養(yǎng)時間的延長先增加后下降的趨勢，說明預(yù)培養(yǎng)的時間對轉(zhuǎn)化率的影響可能與所選用植物材料等有關(guān)系。

本試驗成功建立了虎杖莖尖為轉(zhuǎn)化受體、以潮霉素為篩選劑的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，但虎杖莖尖的轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)低于棉花［20］、小麥［9］等作物的莖尖轉(zhuǎn)化效率，所以該遺傳轉(zhuǎn)化體系還有待優(yōu)化。后續(xù)工作可以從農(nóng)桿菌菌株、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法結(jié)合漩渦振蕩、真空負(fù)壓處理等方面來進一步優(yōu)化該轉(zhuǎn)化體系。

本試驗希望通過提高關(guān)鍵酶基因PcRS在虎杖中的表達水平，調(diào)控虎杖中白藜蘆醇的生物合成。PCR和Southern雜交檢測，表明外源基因已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)基因植株的基因組中。但是本試驗只進行EcoRI 酶的單酶切，還不能準(zhǔn)確確認(rèn)外源基因插入的拷貝數(shù)和位點。在后續(xù)Southern雜交試驗中可以采用多個限制性內(nèi)切酶進行單酶切，或者采用雙酶切。另外轉(zhuǎn)基因植株的遺傳穩(wěn)定性、外源基因的表達、活性成分的含量變化等方面還需要進一步深入研究。

4 結(jié)論

采用根癌農(nóng)桿菌EHA105 菌株侵染虎杖莖尖較適宜的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)為：預(yù)培養(yǎng) 2 d，農(nóng)桿菌菌液濃度OD600為0.6，侵染10 min，共培養(yǎng) 3 d，在篩選培養(yǎng)基中添加 8 mg/L潮霉素，待篩選獲得的抗性芽生長至 3-5 cm高，再轉(zhuǎn)至根誘導(dǎo)培養(yǎng)基使其長成完整植株。利用該體系成功實現(xiàn)虎杖莖尖遺傳轉(zhuǎn)化白藜蘆醇合酶基因，本研究結(jié)果為拓寬虎杖遺傳轉(zhuǎn)化受體提供了技術(shù)和方法。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation of Shoot Tip of Polygonum cuspidatum

Liu Zhongyu1Zhao Shujin2
（1. College of Life Sciences，Yangtze University，Jingzhou 434025；2. General Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou 510010）

In order to establish Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation system of Polygonum cuspidatum shoot tip, some key factors that affect transformation frequency of P. cuspidatum shoot tip were studied. The shoot tips of P. cuspidatum was infected by Agrobacterium tumefaciens EHA105 with the plasmid which contains PcRS gene. The superior transformation system was as following, precultured 2 days and then infected 10 minutes in suspension（OD600=0.6）, co-cultured 3 days, transgenic tissues and shoots were selected with 8 mg/L hygromycin. Six transgenic plants from 300 explants were obtained and the intergration of transgene was confirmed by PCR and Southern blot analysis.

Polygonum cuspidatum Shoot tip Agrobacterium tumefaciens Genetic transformation

2013-08-19

廣東省自然科學(xué)基金（10151001002000012），長江大學(xué)博士啟動基金項目（801100010122）

柳忠玉，女，博士，講師，研究方向：中藥生物技術(shù)；E-mail：zyliu2004@126.com

趙樹進，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：生物制藥；E-mail：gzzsjzhs@163.com