梅玲玲,龔 璞,占 利,張俊彥,張?jiān)柒?/p>

副溶血性弧菌為沿海地區(qū)引發(fā)食物中毒的主要病原菌[1-2]，日本每年由副溶血性弧菌引起的食源性病例約為2萬例[3]。我國臺灣地區(qū)由副溶血性弧菌引起的疾病占細(xì)菌性食源性疾病的半數(shù)以上[4]，內(nèi)陸1992-2001年間的微生物性食源性疾病暴發(fā)事件中由副溶血性弧菌引起的占31.1%[5]。2007年浙江省77起食物中毒事件中，由副溶血性弧菌引發(fā)的為35起，792例，占發(fā)病總起數(shù)和總?cè)藬?shù)的45.45%和55.00%，占微生物性食物中毒的68.6%、69.3%[6]。副溶血性弧菌引發(fā)的食源性疾病對社會穩(wěn)定、人民健康造成了比較大的危害。

多位點(diǎn)測序分型技術(shù)(Multi locus sequence typing，MLST)是為研究菌群基因結(jié)構(gòu)而設(shè)計(jì)的一種高分辨率分型技術(shù)[7]。該方法通過對多個管家基因核酸序列的分析，依據(jù)等位基因的多樣性，確定菌株的序列型，非常適用于流行病學(xué)研究，并可通過互聯(lián)網(wǎng)上的數(shù)據(jù)庫對不同國家、地區(qū)分離的菌株進(jìn)行比較，至今已成功應(yīng)用于多種病原體的研究。本文針對浙江省不同來源樣品中分離的副溶血性弧菌O3∶K6血清型菌株進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型，通過與PubMLST數(shù)據(jù)庫中菌株基因型比對，分析不同來源分離菌株間的親緣關(guān)系，以掌握浙江省不同來源的副溶血性弧菌O3∶K6血清型菌株在遺傳進(jìn)化間的關(guān)系，為開展副溶血性弧菌分子分型研究，制定有針對性的預(yù)防控制措施提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1菌種來源 62株副溶血性弧菌O3∶K6血清型菌株為本中心保存菌株，其中30株分離于不同地區(qū)的門診腹瀉病人，21株分離于15起食物中毒事件的病人，7株分離于食品污染物，4株分離于市售食品。11株分離于2005年，2株分離于2007年，35株分離于2008年，12株分離于2009年，2株分離于2010年。所有菌株經(jīng)VITEK全自動微生物鑒定分析系統(tǒng)鑒定符合副溶血性弧菌的生化特性。用日本生研株式會社生產(chǎn)的抗血清鑒定為O3∶K6血清型。神奈川試驗(yàn)結(jié)果均為陽性。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器、試劑 5331型梯度PCR儀為德國Eppendorf公司產(chǎn)品； BIO-RAD T2A型全自動數(shù)碼成像儀分析系統(tǒng)由美國 BIO-RAD科技公司生產(chǎn)；高保真TaqDNA聚合酶PCR試劑盒購自寶生物工程有限公司。

2 方 法

2.1MLST目標(biāo)基因的選擇和引物的設(shè)計(jì)與合成 選擇副溶血性弧菌dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC及tnaA7個管家基因作為MLST分析基因。PCR擴(kuò)增和測序引物引用http://pubmlst網(wǎng)站上發(fā)表的副溶血性弧菌PCR引物序列(表1)，由上海生工生物工程有限公司合成。引物在使用前將其稀釋到25 μmol/L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 用于MLST分析的7對引物實(shí)驗(yàn)參數(shù)

*：上游引物中tgtaaaacgacggccagt部分，下游引物中caggaaacagctatgacc部分為通用測序引物序列部分。

Note: Universal sequencing primer sequences fortgtaaaacgacggccagtin forward primers andcaggaaacagctatgaccin the reverses.

2.2DNA提取 挑取單個菌落懸浮于3 mL 無菌ddH2O中，用麥?zhǔn)蠞岫葍x調(diào)至1個麥?zhǔn)蠁挝?，吸? mL轉(zhuǎn)移至Eppendorf管，12 000 r/min離心5 min，棄上清，加1 mL 無菌ddH2O，振蕩均勻，100 ℃煮沸15 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液作為反應(yīng)模板， 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3MLST分型

2.3.1PCR擴(kuò)增靶基因片段 50 μL的PCR反應(yīng)體系包括：ddH2O 33.25 μL， Premix Ex TaqTM(10×) 5 μL，TaKaRa Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL、MgCl2(25 mmol/L) 3.25 μL，dNTP 4 μL，上、下游引物 (25 μmol/L)各0.5 μL，模板DNA 2.0 μL；PCR反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性5 min； 96 ℃變性1 min，59 ℃～57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30次循環(huán)后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在加入EB(溴化乙錠)的1.5 %瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察擴(kuò)增效果。recA、gyrB、dnaE、dtdS、pntA、pyrC及tnaA基因?qū)?yīng)的擴(kuò)增片段長度分別為773 bp、629 bp、596 bp、497 bp、 470 bp、533 bp、463 bp。

2.3.2管家基因位點(diǎn)的測序及數(shù)據(jù)分析 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托杭州華大基因公司進(jìn)行雙向測序。測序結(jié)果經(jīng)Chromas軟件和DNA Star軟件處理后，上傳至http://pubmlst副溶血性弧菌數(shù)據(jù)庫(V.parahaemolyticusDatabase Profiles)比對，獲得各管家基因位點(diǎn)的等位基因數(shù)值，并形成相應(yīng)的等位基因譜，提交MLST網(wǎng)站，確定副溶血性弧菌O3∶K6血清型菌株的序列分型(Sequence Type，ST)，并與數(shù)據(jù)庫中的國內(nèi)或國際分離菌株做進(jìn)化關(guān)系分析。

3 結(jié) 果

3.1管家基因擴(kuò)增片段結(jié)果 采用經(jīng)過優(yōu)化的退火溫度、分別擴(kuò)增副溶血性弧菌基因組上的7 個管家基因位點(diǎn)(recA、gyrB、dnaE、dtdS、pntA、pyrC和tnaA基因)目標(biāo)片段結(jié)果，62株菌株均擴(kuò)增出7 個管家基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸濃度及純度均符合測序要求(圖1)。

圖1 7個管家基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.1AgarosegelelectrophoresisofPCRamplificationproductofsevenhousekeepinggenes

1:08-江干-Y-72;2:05-紹-Y-34；3：09-W-367；4：08-寧-Y-4；5：09-安-毒-54;M：DNA marker

3.2副溶血性弧菌MLST分型 將等位基因譜提交MLST網(wǎng)站結(jié)果，62株副溶血性弧菌中59株為ST-3型(3，4，19，4，29，4，22)克隆群株，1株菌株MLST序列型為ST-121(3，2，82，52，4，78，66)，編號為09-W-114的菌株為新發(fā)現(xiàn)的序列型(5，10，34，27，77，49，23)，編號為08-江干-Y-75的菌株gyrB基因序列與AP4(Allelic profile)有很大的相似度，僅在第562位點(diǎn)上由T堿基突變?yōu)镃堿基，其余基因等位基因圖譜與ST-3型相同。

3.3副溶血性弧菌系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系 通過在線軟件Start2，根據(jù)UPGMA法[10]繪制基因系統(tǒng)發(fā)生樹，分析結(jié)果顯示：62株副溶血性弧菌及數(shù)據(jù)庫中引用的菌株的序列型分為5個基因群(圖2，從上到下依次命名為A群，B群，C群，D群，E群)。

由圖2可見，ST-3序列型和ST-121序列型同屬C群，但在不同的分枝點(diǎn)上。09-W-114菌株為新發(fā)現(xiàn)的序列型，屬于D群。ST-3序列型與ST-121序列型的菌株的親緣關(guān)系較近，與09-W-114菌株在進(jìn)化樹上的距離較遠(yuǎn)。

圖2 副溶血性弧菌UPGMA系統(tǒng)發(fā)生樹

4 討 論

副溶血性弧菌是浙江省主要食源性病原菌，近十年來，由副溶血性弧菌引起的食物中毒事件居細(xì)菌性食物中毒的首位，開展副溶血性弧菌遺傳進(jìn)化關(guān)系及其群體遺傳學(xué)特征研究對副溶血性弧菌病的預(yù)防和控制具有重要意義。多位點(diǎn)序列分型利用所測定的管家基因的核苷酸序列組合進(jìn)行編碼分型，可有效分析不同時間不同地區(qū)臨床分離株的遺傳相關(guān)性，特別是多地域相關(guān)性微生物的流行病學(xué)、種內(nèi)微進(jìn)化、來源追蹤和抗生素耐受研究，并且其克服了不同實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)重復(fù)性及可比性差的缺點(diǎn)，可進(jìn)行數(shù)據(jù)共享[7-9]。本次通過對不同來源樣品中分離的副溶血性弧菌O3∶K6血清型菌株進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型研究發(fā)現(xiàn)：浙江省副溶血性弧菌分離株管家基因的等位基因數(shù)僅有3～4個，95.16%(59/62)菌株為ST-3克隆群，從分離對象來看，59株ST-3克隆群副溶血性弧菌29株分離自不同地區(qū)門診腹瀉病人，21株分離自15起食物中毒病人，7株分離自食物中毒病人所食用的食物，2株分離自市售食品。表明ST-3克隆群是浙江省高致病性O(shè)3∶K6血清型副溶血性弧菌的主要ST克隆群，這與國外Gonzalez-Escalona[10]等的相關(guān)研究報導(dǎo)一致。因此，作者認(rèn)為浙江省在公共衛(wèi)生監(jiān)測工作中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注ST-3克隆群副溶血性弧菌，加大對食品，尤其是對海產(chǎn)品的副溶血性弧菌的監(jiān)測力度，并引導(dǎo)公眾形成健康的飲食習(xí)慣(食用煮熟的食物)，防制由此類病原菌引起的食源性疾病的暴發(fā)流行。

參考文獻(xiàn)：

[1]Wang Y, Hu QH, Mu J, et al. Etiologic and molecular characteristics ofVibrioparahaemolyticusstrains isolated from diarrheal patients in Shenzhen, in2007-2008[J]. Chin J Epidemiol, 2010, 31(1): 51-55. (in Chinese)

王藝，扈慶華，牟瑾，等．深圳市2007—2008 年腹瀉病副溶血性弧菌監(jiān)測及分子特性分析[J].中華流行病學(xué)雜志, 2010,31(1):51-55．

[2]Chowdhury NR, Chakraborty S, Ramamurthy T, et al. Molecular evidence of clonalVibrioparahaemolyticuspandemic strains[J]. Emerg Infect Dis, 2000, 6(6): 631-636. DOI: 10.3201/eid0606.000612

[3]Kubota K, Iwasaki E, Inagaki S, et al. The human health burden of foodborne infections caused byCampylobacter,Salmonella, andVibrioparahaemolyticusin Miyagi Prefecture, Japan[J]. Foodbore Pathog Dis, 2008, 5(5): 641-648. DOI: 10.1089/fpd.2008.0092.

[4]Chiou CS, Hsu SY, Chiu SI, et al.Vibrioparahaemolyticusserovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(12): 4621-4625.

[5]Liu XM, Chen Y, Wang XY, et al. Foodborne disease outbreaks in China from 1992 to 2001 national foodborne disease surveillance system[J]. J Hyg Res, 2004, 33(6): 725-757. (in Chinese)

劉秀梅,陳艷,王曉英,等.1992-2001年食源性疾病暴發(fā)資料分析-國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)[J].衛(wèi)生研究,2004,33:725-757.

[6]Chen N, Sun L, Jiang XG. A summary of food poisoning in Zhenjiang Province in 2007[J]. Zhejiang J Prev Med, 2009, 21(10): 4241-4244. (in Chinese)

陳娜,孫亮,蔣賢根.浙江省2007年度食物中毒情況分析[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)2009,21(10):4241-4244.

[7]Maiden MC, Bygraves JA, Feil E, et al. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenicmicroorganisms[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95(6): 3140-3145.

[8]Gogarten JP, Doolittle WF, Lawrence JG. Prokaryotic evolution in light of gene transfer[J]. Mol Biol Evol, 2002, 19(12): 2226-2238.

[9]Liu JH, He D, Yang YQ, et al. Application of multilocus sequence typing method on pathogenic microorganisms typing and identification[J]. Microbiology, 2007, 34 (6): 1188-1191. (in Chinese).

劉金華,賀丹,楊艷秋,等.多位點(diǎn)測序分型技術(shù)在病原微生物分型鑒定中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)報,2007,34(6):1188-1191.

[10]González-Escalona N, Martinez-Urtaza J, Romero J, et a1. Determination of molecular phylogenetics ofVibrioparahaemolyticusstrains by multilocus sequence typing[J]. J Bacteriol, 2008, 190(8): 2831-2840. DOI: 10.1128/JB.01808-07