田維鵬，周東輝，張念章，朱興全，宋銘忻

剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)是一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，在全球范圍內(nèi)廣泛感染人類(lèi)和所有恒溫動(dòng)物。該病原能通過(guò)先天性或獲得性途徑感染宿主，是免疫抑制及免疫缺陷人群的主要致死病因之一[1-5]。由弓形蟲(chóng)引起的弓形蟲(chóng)病是一種重要的人獸共患寄生蟲(chóng)病，可造成嚴(yán)重的公共安全問(wèn)題并給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-5]。因而對(duì)于預(yù)防和治療弓形蟲(chóng)病的研究有著至關(guān)重要的意義。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于弓形蟲(chóng)抗原基因的研究主要集中于膜表面抗原(surface antigen，SAG)、微線體蛋白(microneme protein，MIC)、棒狀體蛋白(rhoptry protein，ROP)、致密顆粒蛋白(dense granule protein，GRA)等[6-12]，這四大類(lèi)抗原均為弓形蟲(chóng)入侵和毒力相關(guān)蛋白。它們雖然能夠代表弓形蟲(chóng)入侵宿主階段的大部分蛋白，卻不能代表其它類(lèi)型的抗原蛋白。因而對(duì)于新型抗原基因的研究能夠加快弓形蟲(chóng)病診斷和疫苗方面的發(fā)展，從而減少弓形蟲(chóng)病的危害。

弓形蟲(chóng)胚層發(fā)育相關(guān)蛋白(Toxoplasmagondiiembryogenesis-related protein，TgERP)是弓形蟲(chóng)卵囊發(fā)育階段的特有蛋白，屬于胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryogenesis abundant domain-containing proteins，LEAs)[13]。這類(lèi)蛋白在弓形蟲(chóng)中的功能尚不清楚，但在植物、無(wú)脊椎動(dòng)物和微生物中，關(guān)于LEAs有諸多報(bào)道[14]。LEAs具有顯著的多樣性。雖然其各自的功能尚不清楚，但LEAs被認(rèn)為在抵御各種惡劣外界環(huán)境的變化方面有著至關(guān)重要的作用[15]。TgERP是子孢子特有抗原，定位于卵囊上，推測(cè)與卵囊抵御外界環(huán)境的變化有關(guān)。同時(shí)該蛋白在卵囊上含量豐富，且免疫原性良好[16]，但目前尚未見(jiàn)關(guān)于該基因在不同基因型弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株的遺傳變異研究報(bào)道。本研究首次從不同宿主和地理來(lái)源的15個(gè)弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株中克隆了TgERP基因，并分析了其遺傳變異情況，研究結(jié)果將為進(jìn)一步評(píng)價(jià)該蛋白在弓形蟲(chóng)病的血清學(xué)診斷和基因疫苗等方面的價(jià)值奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1蟲(chóng)株 本試驗(yàn)所用弓形蟲(chóng)樣品Prugniaud(PRU)、TgPLh、QHO、TgC7、PYS和RH，均由家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室寄生蟲(chóng)功能基因課題組保存，其余蟲(chóng)株的基因組DNA由美國(guó)田納西大學(xué)微生物系蘇春雷教授提供。所有蟲(chóng)株的具體信息見(jiàn)表1。

表1 本試驗(yàn)所用弓形蟲(chóng)樣品

Note: 1:Based on genotyping results of Zhou et al. (2011, 2010)[17-18]

1.2主要試劑 PremixTaqVersion2.0、DL2000 DNA Marker和pMD18-T Vector試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品，普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，Wizard? SV Genomic DNA Purification System購(gòu)自Promega公司。

1.3引物設(shè)計(jì) 根據(jù) 網(wǎng)站中的弓形蟲(chóng)VEG株(Gene ID:TGVEG_027520)TgERP基因的序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上游引物(TgERP-F)序列為：5′-ATGGCGACCGAGCACTCACAC-3′，下游引物(TgERP-R)序列為：5′-CTAGCCAAGCTTTTCTTGAACCTT-3′，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.4樣品處理及DNA提取 從液氮里取出弓形蟲(chóng)TgPLh蟲(chóng)株、TgC7蟲(chóng)株、PYS蟲(chóng)株、QHO蟲(chóng)株及RH蟲(chóng)株迅速置于37 ℃水浴中解凍，分別腹腔接種昆明鼠(0.5 mL/只)復(fù)蘇。連續(xù)傳3代后，分別收集感染弓形蟲(chóng)TgPLh株、TgC7株、PYS株、QHO株及RH株昆明鼠的腹水置1.5 mL滅菌的EP管中，600 r/min離心10 min，棄掉上清液，-80 ℃保存。另取人工感染弓形蟲(chóng)PRU株昆明鼠的腦組織，用滅菌的微型剪刀剪碎后碾磨，-80 ℃保存。將上述處理的樣品按照Wizard? SV Genomic DNA Purification System說(shuō)明書(shū)操作步驟提取DNA，提取的DNA置于-20 ℃冰箱保存。

1.5目的基因的克隆 分別以15個(gè)弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株的基因組DNA為模板，用引物TgERP-F/TgERP-R擴(kuò)增TgERP基因。PCR體系為：Premix Taq 12.5 μL、Primers(20 μmol/L)各 0.5 μL、DNA模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。PCR擴(kuò)增條件簡(jiǎn)單描述為：94 ℃ 5 min， 94 ℃ 30 s、57.3 ℃ 30 s、72℃ 1 min共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳由凝膠成像系統(tǒng)攝像。

1.6TgERP基因序列測(cè)定及分析 將上述PCR產(chǎn)物膠回收純化后連接pMD18-T載體，熱激法導(dǎo)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)PCR鑒定的陽(yáng)性菌液送由生工生物科技(上海)有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果連同http://toxodb.org網(wǎng)站下載的VEG株(Gene ID:TGVEG_027520)和ME49株(Gene ID: TGME49_276850)的相應(yīng)序列，利用公式D=1-M/L計(jì)算TgERP基因的種內(nèi)變異率(M代表相同堿基數(shù)，L代表序列堿基總數(shù))[19]。利用Clustal X1.83及Mega 4.0軟件對(duì)獲得的序列進(jìn)行比對(duì)及計(jì)算遺傳距離，然后用Paup4.0程序中的鄰接法(Neighbor-joining method, NJ)繪制種系發(fā)育樹(shù)，并用Puzzle 5.2程序構(gòu)建最大似然樹(shù)(Maximum Likelihood, ML)[20-21]。鄰接法采用Tamura-Nei模型進(jìn)行分析；ML法采用Hky替代模型和Quartet puzzling搜索程序進(jìn)行分析，采用自展檢驗(yàn)(bootstrap test)估算所構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)的可靠性，復(fù)制數(shù)為1 000[21]。

1.7TgERP氨基酸序列的推導(dǎo)與分析 分別將獲得的15株弓形蟲(chóng)的TgERP基因測(cè)序結(jié)果，利用DNAStar軟件翻譯成TgERP蛋白序列后進(jìn)行蛋白序列比對(duì)，分析其在氨基酸水平上的變異。

2 結(jié) 果

2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果 15個(gè)弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株均成功地?cái)U(kuò)增出長(zhǎng)度約300 bp的片段，與預(yù)期目的片段長(zhǎng)度相符，且無(wú)非特異性條帶，空白對(duì)照為陰性(圖1)。

圖1TgERP基因的PCR產(chǎn)物電泳圖

Fig.1AgarosegelelectrophoresisforPCRproductsoftheTgERPgene

M: DNA maker 2000; 1-15: PCR products of TgPLh, TgC7, PYS, QHO, PRU, RH, GT1, PTG, CTG, MAS, TgCgCa1, TgCatBr5, TgWtdSc40, TgCatBr64, and TgToucan for TgERP gene;

16: Negative control.

2.2測(cè)序結(jié)果及分析 從15個(gè)弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株中擴(kuò)增的TgERP基因長(zhǎng)度均為315 bp，A+T含量在46.67%～46.98%之間。利用DNAStar 5.0的Megalign軟件分析15個(gè)TgERP基因序列發(fā)現(xiàn)，僅在核苷酸序列的第224位發(fā)生了堿基的變異，變異率為0%～0.32%。其中TgPLh株、RH株、GT1株、MAS株、TgCatBr5株、TgCatBr64株及TgToucan株序列相同。

2.3TgERP基因系統(tǒng)發(fā)生樹(shù) 通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析顯示，用ML和NJ法構(gòu)建的種系發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致(圖2)。其中基因型I型的RH株、TgPLh株和GT1株聚在一個(gè)分支上，基因型II型的PTG株、QHO株、PRU株和基因型Ⅲ型的弓形蟲(chóng)CTG株聚在同一個(gè)分支上，其余基因型為稀有型的蟲(chóng)株在兩個(gè)分支上均有出現(xiàn)。TgERP基因序列無(wú)法區(qū)分不同基因型的弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株(圖2)。

圖2 TgERP基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

2.4TgERP氨基酸序列的分析 將15株弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株TgERP基因的ORF利用生物學(xué)軟件進(jìn)行翻譯，結(jié)果表明該段序列共編碼104個(gè)氨基酸。與弓形蟲(chóng)VEG株和ME49的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，僅在氨基酸序列的第75位發(fā)生纈氨酸與丙氨酸的變異，變異率在0%～0.96%之間(圖3)。

圖3 TgERP氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果

3 討 論

TgERP是卵囊階段的特有蛋白，在卵囊壁上含量豐富，具有較好的反應(yīng)原性[12]。Hill等[18]應(yīng)用該蛋白建立了ELISA診斷方法，對(duì)農(nóng)場(chǎng)飼養(yǎng)動(dòng)物的弓形蟲(chóng)卵囊感染情況進(jìn)行了初步調(diào)查，證明卵囊污染在所檢測(cè)地區(qū)普遍存在。為了闡明TgERP基因在不同基因型弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株的序列變異規(guī)律，本研究首次從不同宿主和地理來(lái)源的15個(gè)弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株中克隆了TgERP基因。經(jīng)核苷酸序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，該基因的變異率為0%～0.32%。對(duì)推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，變異位點(diǎn)僅發(fā)生在氨基酸序列的第75位，說(shuō)明該蛋白在不同基因型的弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株中變異很小，具有高度的保守性。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，ML法和NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致。TgERP基因序列雖然能夠區(qū)分弓形蟲(chóng)基因型I型和基因型II/III型蟲(chóng)株，但不能完全區(qū)分所有弓形蟲(chóng)基因型蟲(chóng)株，不適合作為遺傳標(biāo)記分子來(lái)研究弓形蟲(chóng)的基因分型。

TgERP基因編碼的蛋白序列僅在第75位發(fā)生纈氨酸與丙氨酸的變異，變異率為0%～0.96%，表明該蛋白在不同弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株中高度保守，可以作為血清學(xué)診斷方法的候選抗原，也可能作為疫苗研究的候選抗原，值得進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Montoya JG, Liesenfeld O. Toxoplasmosis[J]. Lancet, 2004, 363(9425): 1965-1976.

[2]Weiss LM, Dubey JP. Toxoplasmosis: A history of clinical observations[J]. Int J Parasitol, 2009, 39(8): 895-901. DOI: 10.1016/j.ijpara.2009.02.004

[3]Zhou P, Chen Z, Li HL, et al.Toxoplasmagondiiinfection in humans in China[J]. Parasit Vectors, 2011, 4: 165. DOI: 10.1186/1756-3305-4-165

[4]Dubey JP. Toxoplasmosis of animals and humans[M]. 2nded. Boca Raton: CRC Press, 2010: 313.

[5]Dubey JP, Jones JL.Toxoplasmagondiiinfection in humans and animals in the United States[J]. Int J Parasitol, 2008, 38(11): 1257-1278. DOI: 10.1016/j.ijpara.2008.03.007

[6] Meng M, He S, Zhao G, et al. Evaluation of protective immune responses induced by DNA vaccines encodingToxoplasmagondiisurface antigen 1 (SAG1) and 14-3-3 protein in BALB/c mice[J]. Parasit Vectors, 2012, 5: 273. DOI: 10.1186/1756-3305-5-273

[7]Yuan ZG, Ren D, Zhou DH, et al. Evaluation of protective effect of pVAX-TgMIC13 plasmid against acute and chronicToxoplasmagondiiinfection in a murine model[J]. Vaccine, 2013, 31(31): 3135-3139. DOI: 10.1016/j.vaccine.2013.05.040

[8]Peng GH, Yuan ZG, Zhou DH, et al.Toxoplasmagondiimicroneme protein 6 (MIC6) is a potential vaccine candidate against toxoplasmosis in mice[J]. Vaccine, 2009, 27(47): 6570-6574. DOI: 10.1016/j.vaccine.2009.08.043

[9]Liu MM, Yuan ZG, Peng GH, et al.Toxoplasmagondiimicroneme protein 8 (MIC8) is a potential vaccine candidate against toxoplasmosis[J]. Parasitol Res, 2010, 106(5): 1079-1084. DOI: 10.1007/s00436-010-1742-0

[10]Yuan ZG, Zhang XX, Lin RQ, et al. Protective effect against toxoplasmosis in mice induced by DNA immunization with gene encodingToxoplasmagondiiROP18[J]. Vaccine, 2011, 29(38): 6614-6619. DOI: 10.1016/j.vaccine.2011.06.110

[11]Yuan ZG, Zhang XX, He XH, et al. Protective immunity induced byToxoplasmagondiirhoptry protein 16 against toxoplasmosis in mice[J]. Clin Vaccine Immunol, 2011, 18(1): 119-124. DOI: 10.1128/CVI.00312-10

[12]Chen J, Li ZY, Zhou DH, et al. Genetic diversity amongToxoplasmagondiistrains from different hosts and geographical regions revealed by sequence analysis of GRA5 gene[J]. Parasit Vectors, 2012, 5: 279. DOI: 10.1186/1756-3305-5-279

[13]Fritz HM, Bowyer PW, Bogyo M, et al. Proteomic analysis of fractionatedToxoplasmaoocysts reveals clues to their environmental resistance[J]. PLoS One, 2012, 7(1): e29955. DOI: 10.1371/journal.pone.0029955

[14]Tunnacliffe A, Wise MJ. The continuing conundrum of the LEA proteins[J]. Naturwissenschaften, 2007, 94(10): 791-812. DOI: 10.1007/s00114-007-0254-y

[15]Hundertmark M, Hincha DK. LEA (late embryogenesis abundant) proteins and their encoding genes inArabidopsisthaliana[J]. BMC Genomics, 2008, 9: 118. DOI: 10.1186/1471-2164-9-118

[16]Hill D, Coss C, Dubey JP, et al. Identification of a sporozoite-specific antigen fromToxoplasmagondii[J]. J Parasitol, 2011, 97(2): 328-337. DOI: 10.1645/GE-2782.1

[17]Zhou P, Sun XT, Yin CC, et al. Genetic characterization ofToxoplasmagondiiisolates from pigs in southwestern China[J]. J Parasitol, 2011, 97(6): 1193-1195. DOI: 10.1645/GE-2851.1

[18]Zhou P, Nie H, Zhang LX, et al. Genetic characterization ofToxoplasmagondiiisolates from pigs in China[J]. J Parasitol, 2010, 96(5): 1027-1029. DOI: 10.1645/GE-2465.1

[19]Chilton NB, Gasser RB, Beveridge I. Differences in a ribosomal DNA sequence of morphologically indistinguishable species within theHypodontusmacropicomplex (Nematoda: Strongyloidea)[J]. Int J Parasitol, 1995, 25(5): 647-651.

[20]Li L, Yu LY, Zhu XQ, et al.Orientobilharziaturkestanicumis grouped within African schistosomes based on phylogenetic analyses using sequences of mitochondrial genes[J]. Parasitol Res, 2008, 102(5): 939-943. DOI: 10.1007/s00436-007-0857-4

[21]Liu GH, Gasser RB, Su A, et al. Clear genetic distinctiveness between human- and pig-derivedTrichurisbased on analyses of mitochondrial datasets[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2012, 6(2): e1539.DOI: 10.1371/journal.pntd.0001539