張力　張文娟

[摘要] 目的 探討HCV抗體ELISA檢測1

[關(guān)鍵詞] 丙型肝炎病毒；抗體；酶聯(lián)免疫法

[中圖分類號] R156.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）03-114-04

現(xiàn)臨床丙型肝炎病毒（HCV）感染初步診斷一般依賴于抗體檢測結(jié)果，檢測方法一般為酶聯(lián)免疫吸附法[1]，ELISA法經(jīng)過多年的發(fā)展，靈敏度高、特異性強(qiáng)，在臨床中得到了普遍的應(yīng)用。但是該法存在假陽性情況，且丙肝治療主要用干擾素、利巴韋林等藥物[2]，如若誤診會(huì)加重患者負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致醫(yī)療糾紛。本文探討當(dāng)檢測結(jié)果1

1 材料與方法

1.1 一般資料

2012年1月～2013年9月時(shí)間段內(nèi)在患者知情同意情況下篩選濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)HCV抗體ELISA首次檢測1

1.2 方法與試劑

1.2.1 標(biāo)本采集 清晨空腹采集血液標(biāo)本3mL，真空負(fù)壓式抽血針注入BD公司兔腦粉分離膠-促凝管，采集完畢后37℃水浴箱溫育30min，放入離心機(jī)內(nèi)3000rpm/min離心5min，確認(rèn)血清與紅細(xì)胞分層清晰，無溶血，無纖維蛋白殘留。

1.2.2 儀器和試劑 亞特斯ADALTIS Nexgen Four全自動(dòng)酶免疫分析儀；HCV Ab定性試劑為北京科衛(wèi)（第三代）ELISA試劑盒。

1.2.3 步驟 所有檢測由經(jīng)過培訓(xùn)的工作人員嚴(yán)格遵循廠家操作程序說明和SOP，同時(shí)每次操作均同時(shí)進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控測定，確保每次實(shí)驗(yàn)處于在控狀態(tài)，同時(shí)參加衛(wèi)生部臨檢中心室間質(zhì)量評價(jià)確保結(jié)果合格。嚴(yán)格按照《2010版中國藥典》酶聯(lián)免疫法步驟進(jìn)行操作，操作前將保存于2～8℃冰箱內(nèi)的試劑取出放至室溫環(huán)境下30min，微孔板設(shè)空白對照1孔+陽性對照2孔+陰性對照3孔+標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1孔，每孔為樣品稀釋液100μL，陽性對照、陰性對照、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或待測標(biāo)本10μL。用去離子水按1∶20使用50mL濃縮洗液配置洗滌液。實(shí)驗(yàn)在NEXGEN FOUR內(nèi)根據(jù)預(yù)設(shè)程序進(jìn)行，加入樣本后反應(yīng)時(shí)間60min，洗板加酶后反應(yīng)時(shí)間30min，加入顯色劑A、B液后反應(yīng)時(shí)間30min。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后NEXGEN FOUR使用空白孔校零雙波長450nm/620nm下讀取各孔OD值，然后將將結(jié)果傳輸至康金軟件進(jìn)行判讀。

1.2.4 判斷標(biāo)準(zhǔn) 所有標(biāo)本使用科衛(wèi)試劑分3次進(jìn)行檢驗(yàn)，取3次S/CO均值。1≤S/CO判斷為有反應(yīng)性（R），1>S/CO判斷為陰性（N）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS19.0軟件，數(shù)據(jù)以（）表示，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.001為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對HCV抗體ELISA首次檢測1

對比人群正常體檢人群首次檢測HCV抗體陰性20例，2～6個(gè)月內(nèi)再次檢測仍全為陰性。將首次檢測和2～6個(gè)月再次檢測結(jié)果分為兩組，選擇四格表x2檢驗(yàn)，總例數(shù)n≥40且所有格子的t≥5，x2=27.219，P<0.01兩組數(shù)據(jù)有顯著性差異。

3 討論

丙肝起病隱匿[4]，由于HCV包膜糖蛋白的高變異性以及體外細(xì)胞培養(yǎng)模型缺乏導(dǎo)致丙肝有效疫苗的研制進(jìn)展緩慢[5]，現(xiàn)尚無應(yīng)用于人體的可預(yù)防丙肝病毒感染的有效疫苗[6]。但是丙肝早期可以治愈[7]，同時(shí)丙肝后期時(shí)間長用藥昂貴[8]，所以要求丙型肝炎病毒（HCV）抗體檢測結(jié)果應(yīng)該盡量準(zhǔn)確以便為臨床治療提供有效依據(jù)。但是通過上面46例人群ELISA檢測結(jié)果可以看到，首次檢測有反應(yīng)性26例2～6個(gè)月之間再次檢測有6例抗體檢測結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮裕?0例陰性人群仍為陰性，使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析后得出首次檢測和2～6個(gè)月再次檢測結(jié)果兩組數(shù)據(jù)P<0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所以HCV抗體檢測有反應(yīng)性并不能確診丙肝，應(yīng)同時(shí)加做RIBA實(shí)驗(yàn)[9-10]或進(jìn)行HCV RNA檢測[11]。根據(jù)最終確診結(jié)果可以看出6例抗體首次檢測有反應(yīng)性再次檢測為陰性者未感染HCV，所以如果首次檢測抗體酶標(biāo)法顯示有反應(yīng)性的話，應(yīng)進(jìn)行隨訪檢測，隨訪結(jié)果可有效的避免首次檢測導(dǎo)致的誤導(dǎo)，有助于對感染狀態(tài)做出準(zhǔn)確的判斷。

現(xiàn)跟隨基因技術(shù)的進(jìn)步和制作工藝的提高，丙肝初篩ELISA法經(jīng)過不斷的改良，經(jīng)歷了第一代、第二代試劑，已經(jīng)發(fā)展到第三代，包被微孔板上第三代試劑抗原采用核心區(qū)C22-3抗原和及非結(jié)構(gòu)基因NS3（C22）、NS4（C33c、C100-3）抗原，核心區(qū)抗原比例相對下降，NS3區(qū)C33c比例增高，加入NS5抗原，敏感性、特異性與較第一、二代試劑相比提高較大[12-13]，但是并不能排除假陽性，文獻(xiàn)[14-16]顯示HCV ELISA檢測與HCV RNA等其他方法相比較存在假陽性。

分析酶聯(lián)免疫吸附法假陽性原因主要有以下幾點(diǎn)：（1）試劑因素?？?HCV ELISA試劑盒雖經(jīng)多年發(fā)展，現(xiàn)多采用基因工程重組丙型肝炎病毒抗原包被固相，但是仍存在抗原不純、多克隆抗體和酶結(jié)合物純度低等容易導(dǎo)致假陽性結(jié)果的影響因素[17]。（2）患者體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)干擾，如類風(fēng)濕因子、高免疫球蛋白、超氧化物歧化酶等干擾因素與固相HCV抗原結(jié)合導(dǎo)致顯色假陽性。（3）操作影響。全自動(dòng)酶免分析儀可有效避免加樣不準(zhǔn)確、孵育溫度波動(dòng)、時(shí)間過短、人為失誤等因素，但是標(biāo)本溶血、細(xì)菌污染、凝固不全等因素?zé)o法避免，同時(shí)洗板針堵塞、抽吸不全或注液量不足等導(dǎo)致洗板不徹底的因素，都可引起假陽性。

本研究中工作人員嚴(yán)格按照操作規(guī)程操作，有效避免了人為錯(cuò)誤，分析6例ELISA首次檢測假陽性的原因主要有：批次試劑之間的差異性，部分批次試劑靈敏度過高或特異性較低；患者體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)干擾。

HCV-Ab酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）雖然操作簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)，但是存在較高的假陽性情況，容易對臨床造成誤導(dǎo)。通過首次檢測和2～6個(gè)月再次檢測我們也可得出，雖然HCV抗體ELISA試劑存在假陽性的情況，但是若是在2～6個(gè)月內(nèi)再次進(jìn)行復(fù)查則可有效的排除假陽性情況。報(bào)告顯示[18]全球如非洲等部分地區(qū)醫(yī)療負(fù)擔(dān)較重，人均醫(yī)療水平較低，中國社科院發(fā)布報(bào)告[19]指出我國中西部和農(nóng)村醫(yī)療資源與東部相比差距較大，對于這些可能無法具有RIBA實(shí)驗(yàn)、HCV RNA檢測或發(fā)光檢測的醫(yī)療條件的邊遠(yuǎn)或經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)2～6個(gè)月間復(fù)查可疑HCV抗體結(jié)果比較實(shí)用。當(dāng)然對于HCV抗體ELISA檢測有反應(yīng)性者應(yīng)盡早進(jìn)行HCV-RNA等測定[20]，以便幫助臨床早期確切診斷丙肝。

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（收稿日期：2013-11-03）