張香敏， 張展， 程秀永， 徐發(fā)林， 賈天明， 欒斌， 賈莉婷

圍產(chǎn)期窒息導(dǎo)致的缺氧缺血性腦損傷(hypoxia-ischemia brain damage，HIBD)是新生兒死亡的主要原因之一。近年來，隨著新生兒復(fù)蘇技術(shù)的不斷提高，高危新生兒，尤其是早產(chǎn)兒的病死率有明顯下降，但重度窒息患兒可遺留不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，如腦性癱瘓、癲癇、共濟(jì)失調(diào)及智力低下等。

凋亡是腦損傷的重要機(jī)制之一。有研究證實(shí)：肌肽通過減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而減輕缺血性腦損傷[1-3]，因此推測是否肌肽也能通過減輕細(xì)胞凋亡減輕缺氧缺血性腦損傷。本研究采用7日齡大鼠制作HIBD模型，探討肌肽對(duì)缺氧缺血性腦損傷大鼠凋亡生化指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7日齡清潔級(jí)SD大鼠(證書編號(hào)：SCXK(滬)2008-0016)，雌雄不拘，體質(zhì)量12～18 g，均購自中科院實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)室，并經(jīng)復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有關(guān)保護(hù)條例進(jìn)行，在研究期間新生大鼠與母鼠在同一籠內(nèi)飼養(yǎng)，光照時(shí)間12 h，自由攝食水。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將42只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組(每組14只)：(1)肌肽預(yù)處理組：在HI誘導(dǎo)前30 min腹腔注射肌肽1次250 mg/kg[4，5]；(2)HI組：在相同條件下用等容積的生理鹽水代替；(3)假手術(shù)組：不接受任何治療和處理。

1.2.2 HI模型制作 在室溫(25±2)℃環(huán)境下，將大鼠四肢及頭部固定在手術(shù)臺(tái)上，吸入無水乙醚誘導(dǎo)麻醉；皮膚常規(guī)消毒后小心剪開頸部皮膚，逐層分離暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈，并小心分離迷走神經(jīng)，用4個(gè)0號(hào)外科絲線雙線結(jié)扎該動(dòng)脈并從中間剪斷，造成永久性斷流。此后將大鼠放回到母鼠身邊恢復(fù)1.5 h，氧氮混合氣體(8%氧氣/92%氮?dú)?缺氧箱中持續(xù)通入濕化的氮氧混合氣2 h，缺氧結(jié)束即制成7日齡大鼠HI腦損傷動(dòng)物模型。假手術(shù)組動(dòng)物與HI組動(dòng)物來自同一窩動(dòng)物，動(dòng)物置于相同條件下，既不結(jié)扎血管阻斷血流，也不置于缺氧箱里缺氧，皮膚切一小口，僅分離左側(cè)頸總動(dòng)脈。建模完成后動(dòng)物放回母鼠籠內(nèi)，并送回動(dòng)物房，由專人飼養(yǎng)。

1.2.3 原位末端標(biāo)記(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)染色 HI誘導(dǎo)24 h后，將大鼠稱重并給予吸入無水乙醚麻醉，暴露心臟后在右心房用眼科剪刀剪一小口，然后經(jīng)左心室灌注5 mL生理鹽水，一直到右心房流出清水，再灌入4%多聚甲醛，直到肢體蒼白變硬，迅速剝離腦組織后，然后腦組織在4%多聚甲醛中固定24 h，依次經(jīng)過梯度酒精和二甲苯脫水后，進(jìn)行石蠟包埋，腦冠狀切片厚度為3 μm，用于TUNEL染色(n=5)。使用原位細(xì)胞死亡探測試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)廠家提供的方案進(jìn)行TUNEL染色。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time polymerase chainreaction，Real-time PCR) 根據(jù)廠家提供的說明書，通過細(xì)胞裂解液提取損傷側(cè)海馬的總RNA(Invitrogen，USA)(n=5)，在紫外分光光度計(jì)260 nm處對(duì)RNA進(jìn)行定量，cDNA通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成，嚴(yán)格按照廠家提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，Real-time PCR通過Real-time PCR儀器(Eppendorf，Germany)逐步進(jìn)行，基因序列如下：AIF(126 bp)上游引物，5'-GCC AGG GTC CTC ATC GTA TC-3'下游引物，5'-TCC ATT CCA CTG TCT GAA CTG C-3'；Caspase-3(104 bp)上游引物，5'-GCT GGA CTG CGG TAT TGA G-3'下游引物，5'-CGG GTG CGG TAG AGT AAG C-3'；β-actin(104 bp)上游引物，5'-TGT CAC CAA CTG GGA CGA TA-3'下游引物，5'-CAG CAT GTG TTG GCA TAG AGG TC-3'。

1.2.5 計(jì)算 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的不同濃度梯度的Ct值制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。各樣本的拷貝數(shù)則通過與其內(nèi)參對(duì)照后計(jì)算，并取以10為底的對(duì)數(shù)(log拷貝數(shù))。PCR擴(kuò)增的特異性通過其熔解曲線來確認(rèn)。

1.2.6 免疫印跡 采用免疫印跡技術(shù)檢測AIF及Caspase-3蛋白表達(dá)水平(n=4)，取左側(cè)海馬組織，用蛋白提取試劑盒(購于碧云天生物技術(shù)研究所)提取組織蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定，10%聚丙烯酰胺凝膠帶電泳分離，濕移至醋酸纖維素膜(NC膜)上，10%小牛血清白蛋白室溫?fù)u床上封閉1 h，分別加入稀釋抗體AIF 1∶1 000(美國Millipore公司)；Caspase-3 1∶50(美國Biovision公司)4 ℃冰箱孵育過夜，洗滌后，加入1∶3 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG溶液，室溫?fù)u床上孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光染色，用圖像處理儀進(jìn)行光密度分析，得到各條帶的光密度值，以GADPH作為內(nèi)參照，AIF及Caspase-3與其比值作為相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 肌肽預(yù)處理對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)及海馬TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)的影響 見表1。

表1 大鼠腦組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)的變化

TUNEL陽性細(xì)胞表現(xiàn)HI后凋亡的形態(tài)學(xué)特征，包括染色質(zhì)濃縮和凋亡小體。免疫熒光結(jié)果顯示：肌肽預(yù)處理顯著減少HI 24 h后大腦皮質(zhì)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，與HI組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；同時(shí)，肌肽預(yù)處理也顯著降低HI 24 h后海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，與HI組比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；大腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)在肌肽預(yù)處理組和假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 肽預(yù)處理對(duì)AIF和Caspase-3 mRNA水平的影響 見表2。

表2 大鼠腦組織AIF及Caspase-3基因表達(dá)的變化

為了證實(shí)肌肽預(yù)處理對(duì)AIF和Caspase-3 mRNA水平的影響，通過Real-time PCR檢測HI 24 h后AIF和Caspase-3 mRNA水平。Real-time PCR結(jié)果表明：未經(jīng)肌肽預(yù)處理的HI組動(dòng)物的AIF mRNA表達(dá)高于肌肽預(yù)處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，肌肽預(yù)處理降低了AIF mRNA的表達(dá)，與HI組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)，未經(jīng)肌肽預(yù)處理的HI組動(dòng)物的Caspase-3 mRNA水平也高于肌肽預(yù)處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，肌肽預(yù)處理較為顯著地抑制了HI后Caspase-3 mRNA水平，與HI組比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。但AIF和Caspase-3 mRNA水平在肌肽預(yù)處理組和假手術(shù)組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 肽預(yù)預(yù)處理對(duì)AIF和Caspase-3蛋白水平的影響 見表3。

表3 大鼠腦組織AIF及Caspase-3蛋白表達(dá)的變化

在研究肌肽對(duì)AIF和Caspase-3基因水平影響的基礎(chǔ)上，為證實(shí)肌肽預(yù)處理對(duì)AIF和Caspase-3蛋白水平的影響，通過免疫印跡檢測了肌肽預(yù)處理后AIF和Caspase-3蛋白水平。免疫印跡結(jié)果表明：未經(jīng)肌肽預(yù)處理的HI組動(dòng)物的AIF蛋白水平高于預(yù)處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；同時(shí)，未經(jīng)肌肽預(yù)處理的HI組動(dòng)物的Caspase-3蛋白也表達(dá)高于預(yù)處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。肌肽預(yù)處理不僅顯著地降低了AIF蛋白水平，而且也降低了Caspase-3蛋白水平；AIF和Caspse-3蛋白水平在肌肽預(yù)處理組與HI組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但AIF和Caspase-3蛋白水平在肌肽預(yù)處理組和假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。蛋白水平與基因水平變化趨勢(shì)一致。

3 討論

近年來有關(guān)Capase激活與遲發(fā)性細(xì)胞損傷即凋亡的關(guān)系受到廣泛重視。凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)代表許多潛在的治療機(jī)會(huì)，能夠減輕繼發(fā)性腦損傷，使得臨床治療腦損傷切實(shí)可行。Caspase介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，目前公認(rèn)的各種凋亡刺激因子激活的Caspase家族中的關(guān)鍵蛋白酶是Caspase-3，凋亡可通過Caspase依賴和非Caspase依賴途徑誘導(dǎo)，Caspase的活化是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。AIF是非Caspase依賴細(xì)胞死亡途徑的主要組成部分，代表一種重要的神經(jīng)細(xì)胞死亡機(jī)制。AIF在非Caspase依賴的細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用，當(dāng)HI后，由于氧化應(yīng)激的刺激，引起線粒體內(nèi)膜的跨膜壓減低，線粒體內(nèi)膜的通透轉(zhuǎn)換孔開放，導(dǎo)致線粒體外膜破裂，AIF由線粒體的膜間腔釋放入胞漿，AIF本身是一種脫氧核糖核酸酶，可直接進(jìn)入核內(nèi)，促進(jìn)核染色質(zhì)濃縮和DNA大片段化[6-8]。與此同時(shí)，線粒體膜通透性的改變還可導(dǎo)致細(xì)胞色素C和線粒體源Caspase的第二個(gè)激活因子釋放入胞漿，通過Caspase途徑啟動(dòng)凋亡的發(fā)生。AIF和Caspase途徑在HI介導(dǎo)的神經(jīng)病理學(xué)方面的作用是平行的，互不影響[9]。因此一旦這兩條途徑被激活就可以通過增加神經(jīng)細(xì)胞的凋亡而導(dǎo)致腦損傷。在HI后數(shù)小時(shí)腦組織即開始出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，且隨著HI時(shí)間的延長，凋亡的神經(jīng)細(xì)胞逐漸增加，24 h以后達(dá)到高峰，然后才逐漸減少，并持續(xù)較長的時(shí)間，到HI后第7天仍有較多的凋亡細(xì)胞。與此同時(shí)，機(jī)體的氧化代謝產(chǎn)物MDA含量也因HI而持續(xù)升高，18～24 h達(dá)高峰后逐漸下降，與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的時(shí)程相符合[10]，而氧自由基清除劑SOD的含量在HI后明顯降低。本研究結(jié)果顯示：肌肽預(yù)處理不僅抑制HI誘導(dǎo)的AIF和Caspase-3基因表達(dá)，而且還抑制AIF和Caspase-3蛋白的表達(dá)。

Pekcetin等[1]及許建文等[11]曾報(bào)道：肌肽可顯著降低腦損傷動(dòng)物腦組織TUNEL陽性細(xì)胞的表達(dá)。本研究結(jié)果也表明：肌肽預(yù)處理顯著降低了HI大鼠腦組織TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。由此可推論，肌肽不僅對(duì)其他類型的腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，而且對(duì)HI誘導(dǎo)的腦損傷也具有神經(jīng)保護(hù)作用，而且肌肽的神經(jīng)保護(hù)作用也是通過減少氧化應(yīng)激從而減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡而實(shí)現(xiàn)的。

致謝：非常感謝復(fù)旦大學(xué)衛(wèi)生部新生兒疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供開放合作課題資金贊助及技術(shù)支持。

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